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體外連接法

將外源基因的表達(dá)盒亞*到腺基因組的一個片段上,在體外與腺的基因組相連,重新構(gòu)建成一個完整的腺DNA 分子,轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞,即可獲得重組腺病毒〔10〕。但腺病毒基因組上適宜于*的酶切位點(diǎn)有限,因而限制了該法的應(yīng)用。目前,可利用該法構(gòu)建全缺失載體。

同源重組法

實(shí)驗(yàn)中常將具有共同或重疊序列的兩種DNA 分子,通過共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移到某一生物體內(nèi),在生物體內(nèi)一系列與同源重組有關(guān)的酶的作用下,將DNA 片段由一個DNA 分子(常為含有外源基因的穿梭質(zhì)粒) 轉(zhuǎn)移到另一個分子(常為含有骨架結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒) 中去。生物體不同,構(gòu)建載體的方法各異。在真核細(xì)胞中進(jìn)行同源重組:分為哺乳動物細(xì)胞和釀酒酵母細(xì)胞兩種。前者常用的為293 和911 細(xì)胞,源于人胚腎及人胚成細(xì)胞,已整合腺基因,可表達(dá)腺E1蛋白,用于增殖E1 區(qū)缺失的腺載體。

構(gòu)建時,需歷經(jīng)篩選及噬斑純化等過程,效率低、費(fèi)時,且技術(shù)條件要求高。已報道利用釀酒酵母細(xì)胞經(jīng)過兩次重組過程將外源基因置換到腺的基因中,與哺乳動物細(xì)胞相比,用釀酒酵母細(xì)胞構(gòu)建腺載體有一定的優(yōu)越性。例如,可用Southern 雜交技術(shù)直接鑒定酵母細(xì)胞*中是否含有腺載體,易于獲得重組的陽性*,但重組前要將完整的腺基因組*到酵母人工染色體( YAC) 中,并需要從較大量(至少500 ml) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的酵母細(xì)胞里提取YACs ,重組時,要在擬重組的區(qū)域內(nèi),將腺DNA 分子線性化,由于涉及的DNA 分子較大,做到此點(diǎn)有時也并非易事。

在原核細(xì)胞中進(jìn)行同源重組:所有*的操作,尤其是同源重組的過程可利用大腸埃希菌高效的同源重組機(jī)制在工程菌(如BJ5183) 中完成,重組效率高,在轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞前已完成對載體的鑒定工作,因而避免了反復(fù)鑒定及純化的麻煩,大大縮短生產(chǎn)載體的時間,可在20 d 內(nèi)獲得重組腺〔14 ,15〕。目前,許多實(shí)驗(yàn)室正在利用該法制備重組腺。