固定相構(gòu)造差異

裝填有多孔介質(zhì)的色譜柱，固定相由多孔顆粒（porous particle）組成。如果把一個多孔顆?？醋魇乔蛐危敲辞蝮w表面會有許多孔，孔內(nèi)部有眾多溶質(zhì)分子的結(jié)合位點。顆粒的直徑稱為粒徑，孔的直徑稱為孔徑。顆粒之間的空間稱為空隙體積。Buffer溶液是無法流穿多孔顆粒介質(zhì)內(nèi)部的，他們永遠選擇顆粒間隙阻力最小的流路。

整體柱（monolith）由一整塊高度連通的管道組成，流體在均勻分布的管道里流動。整體柱基質(zhì)由聚甲基丙烯酸酯組成，管道的平均大小是2um。在整體柱內(nèi)部，每個管道與其他16個，甚至更多的管道連通。管道的高連通性有助于流體的均勻分布，減少運行壓力，實現(xiàn)高流速，低柱壓。整體柱整個管道的表面都可以用于結(jié)合溶質(zhì)分子，從而造成固定相擁有很高的結(jié)合容量。

=多孔顆粒填充柱和整體柱

傳質(zhì)方式差異

固定相介質(zhì)構(gòu)造差異造成色譜內(nèi)流體模式和溶質(zhì)傳質(zhì)方式的差異，進而引起溶質(zhì)分子結(jié)合效率和洗脫效率的差異。對于色譜的固定相來說，其動態(tài)結(jié)合容量（dynamic capacity）取決于生物分子的大小，可接觸到的表面積以及生物分子實現(xiàn)傳質(zhì)的方式。

擴散和對流基本概念

生物分子從流動相移動到固定相的過程，稱為傳質(zhì)（mass transport）。在流體中，實現(xiàn)溶質(zhì)傳質(zhì)的方式有2種，一種是擴散（diffusion），一種是對流（convection）。

擴散的驅(qū)動力是分子朝著隨機方向的熱運動，統(tǒng)計學(xué)上表現(xiàn)為順濃度梯度。當(dāng)物質(zhì)在空間中的分布存在濃度差時，濃度差就會引起擴散，最終隨著時間的推移，物質(zhì)在空間上的分布更加均勻。

對流是由外力驅(qū)動的流體整體運動引起的質(zhì)量傳遞，例如，液體水的流動會輸送水中溶解的分子或者離子。在色譜中，這種外力是由泵或者重力產(chǎn)生的壓力差，壓力差會引起介質(zhì)整體的流動。

這些概念代表是色譜吸收基質(zhì)的理想狀態(tài)，實際情況下，固定相配體和溶質(zhì)之間的吸引作用或者排斥作用起 的主導(dǎo)作用。但是，了解溶質(zhì)傳質(zhì)的方式對于理解不同介質(zhì)的性能是非常有必要的。

多孔介質(zhì)中的擴散傳質(zhì)

一個5000bp 的質(zhì)粒DNA，其質(zhì)量是3MDa，而巨無霸蛋白IgM的質(zhì)量才只有960KD。在色譜環(huán)境中，核酸分子要表現(xiàn)得比相同質(zhì)量的蛋白分子大很多。從統(tǒng)計學(xué)上講，生物分子在空間隨機翻轉(zhuǎn)，表現(xiàn)得更像是一個球體，其直徑等于最長構(gòu)象。生物分子在流體中的直徑，并不直接和質(zhì)量相關(guān)，而是取決于水合直徑（hydrodynamic diameter）。相同質(zhì)量的分子，線性構(gòu)象的分子要表現(xiàn)得比球狀構(gòu)象的分子更大，例如線性質(zhì)粒DNA，線性構(gòu)象的RNA分子。也就是說，不管是單純從質(zhì)量上來說，還是從水合直徑上來看，核酸都屬于超級大分子。

生物分子的大小是非常重要的，因為它決定著擴散速率。擴散是分子從高濃度區(qū)域向濃度低區(qū)域的隨機熱運動，非常緩慢，而且隨著分子變大，擴散會變得更慢。舉例說明，1.2kb RNA分子，其質(zhì)量是400KD，分子大小是107nm，而IgG蛋白分子量是155KD，其分子大小是11.5nm。1.2kb RNA分子擴散系數(shù)要比IgG蛋白慢10倍多，打個比方，IgG從大拇指指甲蓋的中心擴散到最邊緣需要超過1年的時間，那么107nm RNA分子需要超過10年的時間。

在色譜中，固定相和流動相之間的距離非常小，納米級到微米級，但是對于依靠擴散的方式來實現(xiàn)生物分子傳質(zhì)過程的多孔介質(zhì)來說，這樣的距離是非常大的。在裝填多孔顆粒的色譜柱中，擴散是溶質(zhì)分子進出顆?？讖絻?nèi)部的 方式（因為孔徑內(nèi)部的流速為0），溶質(zhì)分子越大，擴散就越慢，那么固定相多孔介質(zhì)的動態(tài)結(jié)合容量就越低。

此外，在多孔顆粒色譜中，對流傳質(zhì)和擴散傳質(zhì)的相互作用也會造成固定相介質(zhì)結(jié)合容量的降低。在對流將生物大分子沖走之前，它有一個非常短的時間擴散進入多孔顆粒內(nèi)部。流速越快，窗口時間就會越短，溶質(zhì)來不及擴散進入顆粒孔徑內(nèi)部，就已經(jīng)通過對流沖走了，因此顆粒的結(jié)合容量就會越低。由于生物大分子擴散系數(shù)降低引起的色譜固相介質(zhì)結(jié)合容量的降低，可通過降低流速來彌補?？偨Y(jié)來說，在多孔顆粒介質(zhì)中，固定相結(jié)合容量跟流速和溶質(zhì)大小成反比。

整體柱中的對流傳質(zhì)

固相介質(zhì)孔徑和結(jié)合表面積差異

大分子物質(zhì)，比如核酸，在整體柱中擁有更高的結(jié)合容量，這也同整體柱為生物大分子提供了一個更大的結(jié)合表面積有關(guān)。對于整體柱來說，內(nèi)部管道的整個表面積都是可以被溶質(zhì)分子結(jié)合的。

在多孔介質(zhì)色譜柱中，溶質(zhì)分子可以毫無障礙地接觸到顆粒外部全部的表面積，但是外部表面積只占到顆?？讖絻?nèi)部表面積的2%。只有更大的顆?？讖讲拍苋菁{更大的溶質(zhì)分子，但是，溶質(zhì)分子要毫無限制地結(jié)合到顆?？讖絻?nèi)部表面，需要顆粒的平均孔徑超過溶質(zhì)分子十倍之多。多孔介質(zhì)的孔徑超過100nm是非常罕見的，因為孔徑過大會降低顆粒穩(wěn)定性。

1998年，有人用共聚焦顯微鏡觀察到質(zhì)粒DNA主要吸附在顆粒的外表面,無法進入顆粒內(nèi)部 。多孔介質(zhì)對于蛋白來說，具有更高的結(jié)合能力，因為蛋白可以進入顆?？讖絻?nèi)部，占據(jù)孔徑內(nèi)表面。在蛋白和核酸混合物中，這意味著蛋白會優(yōu)先占據(jù)顆?？讖絻?nèi)部空間。盡管這樣會把顆粒外部大量的表面積留給核酸大分子，但不幸的是，顆粒外表面積只占據(jù)整個可結(jié)合表面積極其小的一部分，對于介質(zhì)結(jié)合容量的改善微乎其微。

在整體柱中，不管大小，所有的溶質(zhì)分子均有同等的機會結(jié)合到開放管道內(nèi)表面上。這樣會造成占據(jù)單位表面積的小分子溶質(zhì)結(jié)合質(zhì)量遠遠小于占據(jù)相同表面積的大分子溶質(zhì)結(jié)合質(zhì)量。因此對于整體柱來說，大分子溶質(zhì)會產(chǎn)生更高的結(jié)合容量。相反，多孔介質(zhì)無法從這樣的關(guān)系中獲益，因為大分子低下的擴散系數(shù)會限制其實現(xiàn)單位表面積的飽和占據(jù)。

因此，從顆?？讖胶徒橘|(zhì)單位面積的結(jié)合質(zhì)量來看，整體柱更適合大分子溶質(zhì)，因為其可以提供更高的介質(zhì)結(jié)合容量。而對于小分子（蛋白）來說，多孔介質(zhì)具有更高效的結(jié)合能力。

固相介質(zhì)彌散差異

簡單來說彌散（dispersion）是由于流體速度差異造成的。當(dāng)流體流過管道時，由于摩擦力的存在