接下來為大家隆重介紹 BIA Separations 提供的，基于對(duì)流相互作用介質(zhì)（CIM）層析整體柱的兩步質(zhì)粒 DNA（pDNA）純化平臺(tái)！
該方法除了具有以上全部?jī)?yōu)點(diǎn)，并且可以純化時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，使其成為 GMP 環(huán)境下的大規(guī)模 pDNA 純化的選擇。
該方法專為純化大分子和納米顆粒的整體柱而設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)快速操作，高流量，同時(shí)提供動(dòng)態(tài)結(jié)合能力和分辨率。

首先要為整個(gè)過程中的核心——兩步層析步驟，準(zhǔn)備細(xì)菌培養(yǎng)液

1. 大腸桿菌收獲、裂解－堿裂解：

這是快速高效純化質(zhì)粒 DNA 亞型的基礎(chǔ)。

操作建議：

先收集菌體；
然后采用堿性裂解法制備原料；

再將細(xì)菌細(xì)胞（通常是細(xì)胞生物質(zhì)或細(xì)胞沉淀）懸浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

通過加入等體積的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 進(jìn)行裂解。

2. 裂解液濃縮：

氯化鈣沉淀后澄清，除去了大量的主要樣品雜質(zhì)

裂解后，懸浮液變粘稠，通過加入與懸浮緩沖液等體積的，4-8℃ 冷卻的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀細(xì)胞碎片和 SDS 復(fù)合物。

在溫和混合下，緩慢加入 CaCl2 并孵育 15 分鐘。

TIPS:

1. 氯化鈣用作沉淀劑，以去除 RNA、基因組 DNA 和其他雜質(zhì);

2. 較高濃度的雜質(zhì)需要 CaCl2 濃度高達(dá) 1M;

3. 考慮測(cè)試多種濃度并評(píng)估產(chǎn)品中雜質(zhì)的有效去除和未受影響的 pDNA 產(chǎn)量;

4. 加入速度應(yīng)該很慢，以防止局部溫度上升;

5. 孵育后，進(jìn)行一系列澄清步驟，從離心或粗過濾開始，例如 80μm 深度過濾，并以 1-5μm 過濾結(jié)束。

（低溫有利于沉淀，混合過程應(yīng)該溫和操作，以防止 DNA 降解。）

前面 blabla 說了那么多，然而純化才是本工藝的精華所在。

BIA Separations 的二步純化工藝的穩(wěn)健性、連貫性、時(shí)效性，均堪稱教科書式的經(jīng)典。

步純化的柱子，通過弱陰離子交換，濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA；

步利用疏水相互作用色譜（HIC）的拋光步驟，進(jìn)一步從超螺旋（SC）級(jí) pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。

兩步純化的作用功能明確、互相合作，大大節(jié)省操作步驟和時(shí)間。

AEX 色譜柱（CIMmultus™DEAE）濃縮 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA。

在弱陰離子交換柱上捕獲質(zhì)粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白質(zhì)，樣品結(jié)合需要低電導(dǎo)率，通過稀釋實(shí)現(xiàn)。

隨著增加 NaCl 的梯度洗脫，首先洗脫 RNA，然后洗脫質(zhì)粒 DNA。

層析條件

Monolithic column:	CIMmultus™  DEAE(2 μm)*1
Mobile phase:	Equilibration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA,   pH 7.2
	Washing buffer  A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M   NaCl, pH 7.2
	Elution buffer  A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M   NaCl, pH 7.2
Working flow rates:	0.5 – 5 column volume (CV) /min (具體取決于樣品特性，使用的層析設(shè)備和色譜柱尺寸)

*1 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。

層析方法

1.  用去離子水稀釋細(xì)菌裂解物至電導(dǎo)率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過程中添加的 CaCl2 濃度。

2.  將稀釋的樣品用 0.45μm 過濾器進(jìn)行過濾。

3.  將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  將澄清的稀釋細(xì)菌裂解液進(jìn)行上樣。

5.  用 20 CV 的緩沖液 A1 對(duì)色譜柱進(jìn)行流洗。

6.  用 20 CV 的緩沖液 A2 對(duì)色譜柱進(jìn)行流洗。

7.  用 20 CV 的緩沖液 A3（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

圖 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的質(zhì)粒 DNA 洗脫曲線

在高配體密度丁基修飾的（CIMmultus TM C4 HLD）整體柱上，利用疏水相互作用色譜柱（HIC）的拋光步驟，進(jìn)一步從        超螺旋（SC）級(jí) pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。

為了富集質(zhì)粒 DNA 的超螺旋亞型，將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱（C4 HLD）上。

該步驟進(jìn)一步去除了雜質(zhì)。

層析條件

Monolithic  column:	CIMmultus™ C4  HLD (2 μm)*2
Mobile phase:	Equilibration  buffer B0:   50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M   (NH4)2SO4, pH 7.2
	Washing  buffer  B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7  M (NH4)2SO4, pH 7.2
	Adjustment  buffer: 4 M (NH4)2SO4
	Elution  buffer  B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4  M (NH4)2SO4 , pH 7.2
	Regeneration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2
Working flow  rates:	0.5 – 5 CV/min (具體取決于樣品特性、使用的層析設(shè)備和色譜柱尺寸)

*2 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。

層析方法

1.  調(diào)節(jié)來自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液，每 1 體積（V）洗脫液加入 3 體積（V）的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的緩沖液 B0 來平衡 C4 HLD 柱。

3.  將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣。

4.  用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱。

5.  用緩沖液 B2（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱。

7.  加樣 3 次后，對(duì)柱子進(jìn)行清洗。

圖 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分離超螺旋質(zhì)粒 DNA

·  從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋