實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

參數(shù)規(guī)格：

產(chǎn)品名稱：鉛黃腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒運(yùn)輸

英文名稱：Enterococcus casseliflavus

貨號(hào): GOY-M3949

產(chǎn)品規(guī)格：50T

產(chǎn)品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸

產(chǎn)品保存：-20℃保存

產(chǎn)品有效期：一年

產(chǎn)品及特點(diǎn):

是從土壤農(nóng)桿菌 CP4 菌株中分離得到的抗除草劑草甘膦基因，是轉(zhuǎn)基因植物研究中最為常用的一種篩選標(biāo)記基因，因此本公司根據(jù)探針法 qPCR 原理開發(fā)了專門用于檢測(cè) 鮑皰疹樣病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 根據(jù) 鮑皰疹樣病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，能專一性地檢測(cè)出樣品中的

鮑皰疹樣病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 成分，但不能檢測(cè)其他非 鮑皰疹樣病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 成分。

3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整個(gè)檢測(cè)過程（按一個(gè)樣品計(jì)）所需時(shí)間僅為 2.0 小時(shí)。

6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR。

操作步驟：

下列圖示以Venor Gem OneStep 支原體 常規(guī)PCR 檢測(cè)試劑盒 (一步法)，具體產(chǎn)品操作以說明書為準(zhǔn)。

第1步：樣本處理：

第2步：試劑制備：

第3步：PCR體系建立：

第4步：?jiǎn)?dòng)PCR反應(yīng)

第5步：電泳結(jié)果分析

191bp為內(nèi)控對(duì)照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。

當(dāng)樣本存在支原體污染時(shí)，由于內(nèi)控對(duì)照與支原體DNA存在競(jìng)爭(zhēng)，內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)酰ɡ缰гwDNA＞103拷貝）。

陽性對(duì)照中支原體DNA＞104拷貝，內(nèi)控對(duì)照條帶會(huì)完全消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測(cè)結(jié)果。

如果待測(cè)樣本對(duì)PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)酰ê完幮詫?duì)照相比），此時(shí)應(yīng)先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒），然后再檢測(cè)。

使用方法：

一、稀釋PCR陽性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對(duì)照。

2. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）

fNorethindrone  68-22-4  中文名：炔諾酮  分子式：C20H26O2  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠抗利尿激素/加壓素(mouse AVP/ADH)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝

Norandrostenedione  734-32-7  中文名：19-去甲-4-雄烯二酮  分子式：C18H24O2  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠固(mouse ALD)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝  

n-Octylbenzene  2189-60-8  中文名：  分子式：C14H22  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

Nitrendipine  39562-70-4  中文名：尼群地平  分子式：C18H20N2O6  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠腺病毒（ADV）ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

Nifuroxazide  965-52-6  中文名：硝呋酚  分子式：C12H9N3O5  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠纖維蛋白肽B（FPB）ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠熱休克蛋白70(HSP-70)ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝  Glycodeoxycholic acid  360-65-6  中文名：甘氨脫氧膽酸  分子式：C26H43NO5  度：98.0%  關(guān)鍵詞：  膽烷; 植物提取物; 天然產(chǎn)物; 天然產(chǎn)物庫

小鼠熱休克蛋白70(HSP-70)ELISAKit   ELISA.   96T/48T  Glycerol 1-(26-hydroxyhexacosanoate)  中文名：  分子式：C29H58O5 

小鼠熱休克蛋白60(mouse Hsp-60)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝  Cryptanoside A  98570-81-1  中文名：  分子式：C30H42O10 

小鼠熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝           Glycodeoxycholic acid  360-65-6  中文名：甘氨脫氧膽酸  分子式：C26H43NO5 

小鼠熱休克蛋白60   英文名稱：   Heat shock protein 60   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   Hsp-60  Mepivacaine  96-88-8  中文名：甲哌卡因  分子式：C15H22N2O  度：98.0%  關(guān)鍵詞：Senkyunolide C  91652-78-7  中文名：洋川芎內(nèi)酯C  分子式：C12H12O3    Humanplacealprotein，PPELISAKit人胎盤蛋白(PP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

Docosanoic acid  112-85-6  中文名：二十二烷酸  分子式：C22H44O2    兔子細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1/CD54)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

Pilosol A  501086-15-3  中文名：  分子式：C13H12O    Human plasminogen activator inhibitor (PAI) ELISA Kit 人纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)ELISA試劑盒

Glycerol  56-81-5  中文名：甘油  分子式：C3H8O3    HumanAmylinELISAKit 人胰淀素(Amylin)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

Riligustilide  89354-45-0  中文名：  分子式：C24H28O4    Humandeoxypyridinoline,DPDELISA試劑盒人脫氧酚/脫氧啉(DPD)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

鉛黃腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒運(yùn)輸Tiamulin  55297-95-5  中文名：泰妙菌素  分子式：C28H47NO4S  度：98.0%      小鼠上腺素能a1A受體(ADRA1A)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

Tiagabine hydrochloride  145821-59-6  中文名：鹽酸噻加賓  分子式：C20H26ClNO2S2  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠鈣結(jié)合蛋白(CR)ELISAKit   ELISA.   96T/48T           

Thiamphenicol  15318-45-3  中文名：甲砜霉素  分子式：C12H15Cl2NO5S  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠抑制素B(INH-B)ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

Thevetin B  27127-79-3  中文名：  分子式：C42H66O18  度：97.5%  關(guān)鍵詞：    小鼠抑制素A(INH-A)ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

Thevebioside  114586-47-9  中文名：  分子式：C36H56O13  度：97.0%  關(guān)鍵詞：  強(qiáng)心苷; 甾苷; 植物提取物; 天然產(chǎn)物; 天然產(chǎn)物庫  小鼠抑瘤素M(OSM)ELISA試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

服務(wù)流程：

鉛黃腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒運(yùn)輸1、根據(jù)客戶提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針（染料法只需設(shè)計(jì)引物）

2、抽提DNA、RNA，并對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄

3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

4、提供完整的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告(檢測(cè)數(shù)據(jù)、溶解曲線、擴(kuò)增曲線)

5、返還樣品（引物、RNA和cDNA）