經常有小伙伴對于免疫熒光（IF）的諸多問題不知所措，下面是一些免疫熒光（IF）的常見問題及優(yōu)化方案詳細解答，給受困于免疫熒光（IF）的同胞們謀個福利~

常見問題一：信號弱或無信號，染色細胞過少

可能原因：

1.目標蛋白在細胞中沒有表達

2.表達目標蛋白的細胞過少

3.細胞通透性差

4.染色前的固定步驟破壞了抗原表位

5.通透使抗原丟失

6.抗體不識別

7.一抗稀釋度過大

8.二抗選擇錯誤

優(yōu)化方案（與以上原因相對應）：

1.制備細胞裂解液，用Western Blotting驗證目標蛋白在細胞中是否表達

2.標本中使用更多的細胞，試用其他瞬時轉染方法，或者使用穩(wěn)定轉染細胞系

3.增加通透劑作用的時間或者濃度，或改用其它的通透劑

4.改用其他固定方法

5.減少通透劑作用的時間或強度

6.換用其他抗體

7.同一樣品按zui佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定zui佳的一抗稀釋比例

8.使用正確的二抗

常見問題二：背景過高

可能原因：

1.一抗質量不高

2.一抗?jié)舛忍?/span>

3.二抗?jié)舛忍?/span>

4.封閉不完全

5.封閉液BSA中含IgG

6.洗滌不充分

優(yōu)化方案（與以上原因相對應）：

1.使用特異性高，效價高的一抗

2.同一樣品按zui佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定zui佳的一抗稀釋比例

3.同一樣品按zui佳的一抗用量作二抗稀釋曲線，以確定zui佳的二抗稀釋比例

4.使用二抗來源動物的非免疫血清進行封閉；改善封閉條件

5.使用高純度（IgG free）的BSA

6.充分洗滌

常見問題三：細胞呈扁平狀

可能原因：

1.細胞片被風干

2.使用了甲醇固定

優(yōu)化方案（與以上原因相對應）：

1.在任何時候都不要讓細胞片干燥；使用濕盒

2.甲醇可破壞細胞膜，因此不能很好保持細胞形態(tài)。改用甲醛或戊二醛等其他固定劑

常見問題四：細胞有自發(fā)熒光

可能原因：

1.使用了戊二醛固定

2.材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光

優(yōu)化方案：

在固定后熒光染色前進行熒光淬滅，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光

常見問題五：細胞模糊，封片劑明亮

可能原因：

1.因洗滌不充分導致背景太亮

2.二抗結合太弱

優(yōu)化方案（與以上原因相對應）：

1.充分洗滌

2.確?？贵w牢固結合，確保固定良好

常見問題六：整個細胞片都出現熒光亮點

可能原因：

1.二抗?jié)舛冗^高

2.二抗發(fā)生沉淀

優(yōu)化方案（與以上原因相對應）：

1.降低二抗?jié)舛?/span>

2.過濾或離心熒光標記二抗

以上一共提供了6個常見問題及相應優(yōu)化方案，相對來說比較簡單，更好的實驗結果還是要同志們再次實驗嘗試的，其中實驗試劑的品質也是非常重要的一個環(huán)節(jié)。比如說，正常驢血清就是一個非常典型的實驗試劑，很多熱門研究領域都在使用，大家也可以根據相應問題找到適合自己的實驗試劑。

好了，今天就分享到這里啦，喜歡的小伙伴可以關注一下哦，后期將繼續(xù)分享相關干貨，咱們下期見哦！

正常驢血清鏈接：

http://www.amyjet.com/products/017-000-121.shtml