【中文名稱】禽流感病毒H5/H7/H9亞型(AIV-H5/H7/H9)核酸檢測試劑盒(三重熒光PCR法)

【英文名稱】Three time real time fluorescent PCR for avian influenza

【產品及特點】

禽流感病毒H5/H7/H9亞型(AIV-H5/H7/H9)核酸檢測試劑盒(三重熒光PCR法)是基于熒光染料檢測的即用型 PCR 試劑盒，可以對靶片段進行實時定量PCR 分析（quantitative PCR、qPCR）。產品含有經過優(yōu)化的緩沖液組分、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2及新型熒光染料 DNAgreen 等所有實時定量 PCR 所需要的成分，用戶只需加入模板和引物即可進行實時定量 PCR 反應和 HRM 分析，具有廣泛的用途。

1. 方便，用戶只需準備模板和引物既可以進行實時定量 PCR 實驗和 HRM（High Resolution DNA Melt Curve Analysis）分析。而基于 SYBR Green I 和 LC Green 染料的 qPCR mix 則不能同時用于上述兩種實驗。

2. 使用第三代飽和型熒光染料，信號強，不會抑制 PCR 反應。

3. 快捷，即用型的預配液使加樣操作步驟大大簡化，避免了交叉污染，降低實驗誤差。

4. 各成分的濃度和比例都經過精心優(yōu)化，反應的靈敏度高，特異性強。能檢測到濃度為 50 拷貝/mL 的靶分子。

禽流感病毒H5/H7/H9亞型(AIV-H5/H7/H9)核酸檢測試劑盒(三重熒光PCR法)【規(guī)格及成分】

成分	100次熱封袋包裝
qPCR MagicMix，2×	1 mL
專一性引物對	200 μL
陽性對照	50 μL
超純水	1 mL
使用手冊	1 份

禽流感病毒H5/H7/H9亞型(AIV-H5/H7/H9)核酸檢測試劑盒(三重熒光PCR法)【運輸及保存】

低溫運輸，-20℃保存, 保存期限為 6 個月。

【產品圖片】

【自備試劑】

DNA 模板、引物、超純水。

【使用方法】

1. 以 20 uL 的 qPCR 反應體系為例：在一干凈的 PCR 管中，加入下列成分：

反應體系成分	20 uL 體系	終濃度
qPCR MagicMix，2×	10 uL	1×
自備引物一 a	x uL	0.1-0.5 uM
自備引物二 a	x uL	0.1-0.5 uM
自備模板 a	x uL
自備 ROXb	2 uL	（可以不加）
補超純水到	20 uL

放入熒光 PCR 儀中進行擴增, 并在退火或延長步驟中記錄熒光信號。

注意：

a) 通常引物濃度以 0.2 μM 可得到較好結果，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設定范圍的參考；通常 DNA模板的量以10-100 ng基因組 DNA或1-10 ng cDNA為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定*的模板使用量。

b) ROX 校正染料：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三種型號的熒光 PCR 儀器，則需用自備的 ROX 進行 Ct 值校正。對 ABI 7700 和 7900，ROX 的*濃度為 1×（即在每 20 uL 反應體系中加 2 uL 10×ROX）。對ABI 7500， ROX 的*濃度為 0.05-0.1×（每 20 uL 反應體系加 0.1-0.2uL 10×ROX；也可將 10×ROX 稀釋到 1×，然后每個反應體系加入 1-2 uL1×ROX）。ROX 會在溶解曲線中產生噪音，因此，如果出現(xiàn)了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”選項取消打勾，然后重新分析數(shù)據(jù)。

對于 iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型號的熒光PCR 儀器，ROX 不是必須的，但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。

2. 循環(huán)步驟：根據(jù)擴增子的性質和儀器性能，從以下三個過程中任選一個進行擴增。

A：兩步快速循環(huán)法：適用于引物 Tm 值設計為 60℃的反應

酶活化	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
酶活化	95℃	10 min	1
變性 退火&延伸	95℃ 60℃	15 s 1 min	35-40

注意：本產品所采用的熱啟動酶須在預變性 95℃、10 min 條件下實現(xiàn)酶的活化。

退火溫度請以 60-64℃作為設定范圍的參考，發(fā)生非特異性反應時，可提高退火溫度。

B：三步快速循環(huán)法：適用于延伸步驟溫度高于退火步驟的 PCR（長引物 PCR）

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
酶活化	95℃	10 min	1
變性 退火 延伸	95℃ 56-64℃ 72℃	10 s 30 s 32 s	35-40

禽流感病毒H5/H7/H9亞型(AIV-H5/H7/H9)核酸檢測試劑盒(三重熒光PCR法)注意：

a) 退火溫度：建議采用兩步法 PCR，退火溫度 60℃進行反應。若提高反應特異性，可提高退火溫度，以 60-64℃作為設定范圍的參考。若因使用 Tm 值較低的引物等原 因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試進行三步法 PCR 擴增，三步法的退火溫度請以 56℃-64℃的范圍作為設定參考。延伸溫度：延伸溫度設為 72℃通?？梢蕴岣邤U增效率。但是，對于 AT 含量大于 70%的擴增子來說，延伸溫度設為 60℃為宜。

C：通用循環(huán)法：這種循環(huán)方法適用于幾乎所有的熒光 PCR 儀，也適用于用快速循環(huán)法不能擴增的模版。

酶活化	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
酶活化	95℃	10 min	1
變性 退火&延伸	95℃ 60℃	15 s 60 s	35-40

3. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程