壞死性肝炎細(xì)菌熒光PCR檢測試劑盒(NHPB)【規(guī)格及成分】

壞死性肝炎細(xì)菌熒光PCR檢測試劑盒(NHPB)【運(yùn)輸及保存】

低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 保存期限為 6 個(gè)月。

【產(chǎn)品圖片】

【自備試劑】

DNA 模板、引物、超純水。

【使用方法】

1. 以 20 uL 的 qPCR 反應(yīng)體系為例：在一干凈的 PCR 管中，加入下列成分：

放入熒光 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增, 并在退火或延長步驟中記錄熒光信號(hào)。

注意：

a) 通常引物濃度以 0.2 μM 可得到較好結(jié)果，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設(shè)定范圍的參考；通常 DNA模板的量以10-100 ng基因組 DNA或1-10 ng cDNA為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對(duì)模板進(jìn)行梯度稀釋，以確定*的模板使用量。

b) ROX 校正染料：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三種型號(hào)的熒光 PCR 儀器，則需用自備的 ROX 進(jìn)行 Ct 值校正。對(duì) ABI 7700 和 7900，ROX 的*濃度為 1×（即在每 20 uL 反應(yīng)體系中加 2 uL 10×ROX）。對(duì)ABI 7500， ROX 的*濃度為 0.05-0.1×（每 20 uL 反應(yīng)體系加 0.1-0.2uL 10×ROX；也可將 10×ROX 稀釋到 1×，然后每個(gè)反應(yīng)體系加入 1-2 uL1×ROX）。ROX 會(huì)在溶解曲線中產(chǎn)生噪音，因此，如果出現(xiàn)了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”選項(xiàng)取消打勾，然后重新分析數(shù)據(jù)。

對(duì)于 iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型號(hào)的熒光PCR 儀器，ROX 不是必須的，但加入的話也不會(huì)影響整個(gè) PCR 分析。

2. 循環(huán)步驟：根據(jù)擴(kuò)增子的性質(zhì)和儀器性能，從以下三個(gè)過程中任選一個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增。

A：兩步快速循環(huán)法：適用于引物 Tm 值設(shè)計(jì)為 60℃的反應(yīng)

注意：本產(chǎn)品所采用的熱啟動(dòng)酶須在預(yù)變性 95℃、10 min 條件下實(shí)現(xiàn)酶的活化。

退火溫度請(qǐng)以 60-64℃作為設(shè)定范圍的參考，發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可提高退火溫度。

B：三步快速循環(huán)法：適用于延伸步驟溫度高于退火步驟的 PCR（長引物 PCR）

壞死性肝炎細(xì)菌熒光PCR檢測試劑盒(NHPB)注意：

a) 退火溫度：建議采用兩步法 PCR，退火溫度 60℃進(jìn)行反應(yīng)。若提高反應(yīng)特異性，可提高退火溫度，以 60-64℃作為設(shè)定范圍的參考。若因使用 Tm 值較低的引物等原 因，得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，可嘗試進(jìn)行三步法 PCR 擴(kuò)增，三步法的退火溫度請(qǐng)以 56℃-64℃的范圍作為設(shè)定參考。延伸溫度：延伸溫度設(shè)為 72℃通?？梢蕴岣邤U(kuò)增效率。但是，對(duì)于 AT 含量大于 70%的擴(kuò)增子來說，延伸溫度設(shè)為 60℃為宜。

C：通用循環(huán)法：這種循環(huán)方法適用于幾乎所有的熒光 PCR 儀，也適用于用快速循環(huán)法不能擴(kuò)增的模版。

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