【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬瘟病毒野毒株（CSFV-W）熒光PCR檢測試劑盒

Name ：Real-Time PCR Method

【包裝規(guī)格】48T/盒

豬瘟病毒野毒株（CSFV-W）熒光PCR檢測試劑盒【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測動物腺、肝、脾、肺組織及人痰、血液等標(biāo)本中分離出的指標(biāo)，用于指標(biāo)的定量檢測輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采對指標(biāo)基因設(shè)計特異性的引物和探針，用熒光 PCR 技術(shù)對指標(biāo)的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【注意事項】

所有操作嚴格按照說明書進行；

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；

反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。

豬瘟病毒野毒株（CSFV-W）熒光PCR檢測試劑盒【使用方法】

樣品處理（樣本處理區(qū)）

樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子取 100μL 進行提取。

【標(biāo)本采集】

 無菌注射器抽取血液 3~5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管；有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的，動物戒病人取腦脊液進行檢測；疑似污染的食物取 1g 進行檢測

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但丌能超過 6 個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復(fù)凍融。

1.1樣本前處理

固體樣本：手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；液體樣本：直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；

腦脊液直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；

血液樣本：取抗凝血下層血細胞 50μL，加入 100μL 雙蒸水吹勻。

DNA 提取

對上述處理好的標(biāo)本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

DNA 的提取也可以采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

結(jié)果分析判定

結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果不樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果。

質(zhì)控標(biāo)準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

豬瘟病毒野毒株（CSFV-W）熒光PCR檢測試劑盒【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

患病動物：腺、肝、脾、肺組織、糞便、血液人：痰；尿液、血液

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復(fù)凍融。

【注意事項】

所有操作嚴格按照說明書進行；

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；

反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。