PCR產(chǎn)物回收試劑盒(PCRDNAExtractionKit)

貨號(hào)：ZK-PL4180

品牌：子科生物ZIKER

描述：

本試劑盒采用優(yōu)化的緩沖體系和硅膠柱純化技術(shù)，可從各種濃度的TAE或TBE瓊脂糖凝膠中回收70bp-20kb的DNA片段，溶膠后轉(zhuǎn)入DNA吸附柱在高鹽條件下直接離心即可專一性吸附DNA，去除其它雜質(zhì)。試劑盒也可直接從PCR產(chǎn)物、酶促反應(yīng)體系或其它各種方法獲得的DNA粗制品中純化DNA片段，同時(shí)除去蛋白質(zhì)、其它有機(jī)化合物、無機(jī)鹽離子及寡核苷酸引物等雜質(zhì)?？稍?/span>10-15min完成純化工作。純化的的DNA可直接用于連接、轉(zhuǎn)化、酶切、體外轉(zhuǎn)錄、PCR、測(cè)序、微注射等分子生物學(xué)研究。

適用：

各種濃度的TAE或TBE瓊脂糖凝膠；PCR產(chǎn)物、酶促反應(yīng)體系或其它各種方法獲得的DNA粗制品?；厥掌畏秶鸀?/span>70bp - 20kb。

組成(100次)：

DNA結(jié)合液 80ml

漂洗液 2*20ml（使用前按瓶上指定體積加入無水乙醇）

洗脫緩沖液 20ml

DNA吸附柱 100個(gè)

濾液收集管 100個(gè)

儲(chǔ)存：

4oC或室溫

效期：

一年

操作步驟：

注意：首次使用前按漂洗液試劑瓶標(biāo)簽所示，每20ml加入80ml的無水乙醇，室溫保存。

凝膠回收方案

1. DNA電泳結(jié)束后，在紫外燈下快速切下含目的DNA片段的凝膠，建議用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，并盡量去除多余凝膠。稱取凝膠重量(去除空管重量)，100mg凝膠等同于100μl體積，作為一個(gè)凝膠體積。

2. 加入等倍體積DNA結(jié)合液。50~ 55℃水浴7 - 10min，根據(jù)凝膠大小適當(dāng)調(diào)整時(shí)間，確保凝膠塊完全溶解。水浴期間顛倒混勻2次加速溶膠。

（注意DNA結(jié)合液加入1-3倍體積不影響DNA回收率。若回收小于或等于100bpDNA片段時(shí)，加入3倍體積DNA結(jié)合液，水浴溶膠后，再加入1倍凝膠體積異丙醇，混勻后再按第3步進(jìn)行操作）

3. 短暫離心收集管壁上的液滴。將DNA吸附柱置于濾液收集管中，把≤700μl溶膠液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12,000rpm(13,400×g)離心30- 60sec。若溶膠體積大于700μl，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶膠液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12,000rpm(13,400×g)離心30 - 60sec。

4. 棄濾液，把吸附柱置于收集管中。加入300μlDNA結(jié)合液至吸附柱中。靜置1min。12,000rpm(13,400×g)離心30 - 60sec。

5. 棄濾液，把吸附柱置于收集管中。加入700μl漂洗液 (已加入無水乙醇)至吸附柱中。12,000 rpm(13,400×g)離心30 - 60sec。

注意：請(qǐng)沿吸附柱壁四周加入漂洗液，或加入漂洗液后蓋蓋顛倒混勻2 - 3次有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份。

6. 重復(fù)步驟5，注意：兩次使用漂洗液沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。

7. 棄濾液，把吸附柱置回收集管中。12,000 rpm(13,400×g)離心2 min。

8. 將吸附柱置于在1.5 ml滅菌的離心管中，加入20 - 30 μl 洗脫緩沖液至吸附柱中央，放置2 min。12,000 rpm(13,400×g)離心1 min。棄去吸附柱，把DNA保存于-20℃。

注意：若需要獲得最高產(chǎn)量，建議將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，重復(fù)第8步進(jìn)行二次洗脫?；厥沾笥?nbsp;3 KB的片段時(shí)，建議將Elution Buffer預(yù)熱至55℃以提升回收效率。

PCR反應(yīng)液回收方案

該方案適合于從PCR產(chǎn)物，酶促反應(yīng)液或粗制的DNA(包括基因組DNA)中回收純化DNA。該方案可高效地去除各種核苷酸，引物，引物二聚體，鹽分子，酶等雜質(zhì)。

1. 短暫離心PCR產(chǎn)物，酶促反應(yīng)液或粗制DNA產(chǎn)物(包括基因組DNA)。用移液槍測(cè)量其體積并轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 ml或2 ml離心管中。若樣品體積小于100 μl，用滅菌水補(bǔ)充至100 μl。高濃度的基因組DNA最好用滅菌水稀釋至300 μl，以提高回收效率。

2. 加入5倍體積的DNA結(jié)合液，顛倒或渦旋混勻。若需回收小于100 bp DNA片段，需再加入1.5倍體積(樣品+DNA結(jié)合液的體積)的無水乙醇。

3. 將吸附柱套在收集管中。把≤700 μl溶膠液轉(zhuǎn)移至吸附柱中。10,000 rpm離心30 - 60 sec。若混合液體積大于700 μl，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12,000 rpm離心30 - 60 sec。

4. 后續(xù)步驟按凝膠回收方案第5 - 8步進(jìn)行操作。

注意事項(xiàng)：

1. 首次使用前按漂洗液試劑瓶標(biāo)簽所示，加入80 ml的無水乙醇稀釋，于室溫保存。

2. 若低溫儲(chǔ)存時(shí)，DNA結(jié)合液容易產(chǎn)生沉淀，使用前可室溫放置一段時(shí)間，必要時(shí)可于37℃水 浴鍋預(yù)熱至沉淀完全溶解，混勻后再使用。

3. 提前將水浴鍋溫度設(shè)至50 ~ 55℃。

4. 在步驟1中，將凝膠切成細(xì)小的碎塊可大大縮短凝膠溶化時(shí)間從而提高回收率(線型DNA 長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫條件下易于水解)。勿將含DNA的凝膠長(zhǎng)時(shí)

間地暴露在紫外燈下，減少紫外線對(duì)DNA造成的損傷。

5. 在步驟2中凝膠必須完全溶化，否則將嚴(yán)重影響DNA回收率。

6. 將洗脫緩沖液或去離子水加熱至55℃，有利于提高DNA洗脫效率。DNA分子呈酸性， 建議在2.5 mM Tris-HCl，pH 7.0 - 8.5洗脫液中保存。

常見問題與解決方案:

DNA回收率低

瓊脂糖凝膠未完全溶化：盡可能去除不含目的片段的瓊脂糖，溶膠過程間隔性的搖晃促進(jìn)凝膠充分溶化，仔細(xì)檢查確保無固體瓊脂糖殘留。

回收片段過?。?/span>小于或等于100 bp片段時(shí)，加入1倍體積的異丙醇。

試劑準(zhǔn)備有誤：漂洗液需加入乙醇稀釋或乙醇體積不準(zhǔn)確(乙醇濃度需控制在80%)。

洗脫效率低：將漂洗液預(yù)熱至55℃，并重復(fù)二次洗脫。

下游結(jié)果不理想

鹽污染：確保用漂洗液洗脫兩次；此外沿吸附柱管壁四周加入漂洗液，或加入漂洗液后蓋蓋顛倒混勻2 - 3次有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份。

瓊脂糖殘留：盡可能去除不含目的片段的瓊脂糖，溶膠過程間隔性的搖晃促進(jìn)凝膠充分溶化，仔細(xì)檢查確保無固體瓊脂糖殘留。

洗脫產(chǎn)物中有ssDNA：將洗脫產(chǎn)物95℃加熱2 min，緩慢冷卻至室溫，使單鏈DNA重新退火即可。