細胞核制備試劑盒

貨號：ZK-PL3518

品牌：子科生物ZIKER

描述：

在破碎組織細胞時加入活化劑，幫助裂解細胞，反復(fù)振蕩或使用剪切力釋放細胞核，然后在溫和條件下低速離心收集細胞核。在30-60分鐘內(nèi)完成，無需特殊設(shè)備，簡便易行，重復(fù)性好。適用于從組織塊、貼壁或懸浮培養(yǎng)細胞制備完整高純度細胞核。制備的細胞核仍然保持其在細胞內(nèi)時所具有的形狀和大小，是進行細胞核相關(guān)實驗、研究蛋白核轉(zhuǎn)位、DNA-蛋白相互作用、以及進行WBt和免疫共沉淀的理想材料。

組成：

100mlBuffer1（CER）,5mlReagentA,100mlBuffer2（NER）,for100preparations。

儲存：

短期4oC。可分裝出一部分?20oC保存。

適用：

從組織塊、貼壁或懸浮培養(yǎng)細胞制備完整的細胞核。

Step-1A培養(yǎng)細胞裂解

1.貼壁細胞需消化或刮下細胞，懸浮細胞可直接離心，PBS洗滌，800×g5min收集細胞。計數(shù)，并估計細胞沉淀的體積。每次提取需要1-2107個細胞。通常每1×107個細胞的沉淀體積約100μl。

2.加入10倍于細胞沉淀體積的1ml冰預(yù)冷的Buffer1（CER），振蕩重懸細胞。冰水浴5分鐘。

3.加入1/20體積約50μlReagentA，劇烈振蕩混合。冰水浴5分鐘。再次劇烈振蕩。

4.將細胞裂解物3次或多次通過22號針頭剪切，或用小容積間隙緊密的玻璃勻漿器上下研磨20次。在相差顯微鏡下檢查游離的核應(yīng)達到95%而未裂解細胞應(yīng)少于5%。否則繼續(xù)剪切或研磨。

Step1-B組織塊破碎和裂解1.稱取100-200mg新鮮組織如肝臟、腦，PBS沖洗，加入1ml（約10倍組織體積）冰預(yù)冷的Buffer1（CER）。2.用間隙嚴密的研杵上下研磨培養(yǎng)上下研磨組織10次。冰水浴5分鐘。3.加入1/20體積約50μlReagentA，混合。冰水浴5分鐘。劇烈振蕩。4.在相差顯微鏡下檢查游離的核應(yīng)達到95%而未裂解細胞應(yīng)少于5%，否則繼續(xù)剪切或研磨。5.如有必要，用濾紙過濾組織勻漿裂解物。

Step2細胞核制備

1.將組織或細胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管。1000×g離心3min4oC沉淀細胞核，棄上清。

2.用10倍于胞核體積(~0.5ml)Buffer2(NER)重懸核。2000×g離心10minat4oC，棄上清。

3.重復(fù)步驟2洗滌細胞核。在相差顯微鏡下胞核應(yīng)游離分散在清亮背景下存在顆粒物質(zhì)表明細胞質(zhì)成分殘留；核聚集表明存在粘連性的細胞骨架或染色質(zhì)，通常由于細胞勻漿破碎不足或起始細胞數(shù)太多。

4.棄上清。用50-100μl適宜的緩沖液重懸細胞核，進行下一步實驗?；?qū)顺恋碇苯?70oC保存，注意解凍后會有部分核在融化過程中破裂。

注意：

1.破碎細胞是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細胞特別是貼壁細胞較難破壁。組織細胞裂解物3次或多次通過22號針頭剪切破碎細胞，或用小容積玻璃勻漿器、間隙緊密的研杵上下研磨培養(yǎng)20次。用相差顯微鏡檢查未裂解細胞應(yīng)少于5%。否則繼續(xù)剪切或研磨。2.基于梯度密度離心原理，以離心力g計算正確的離心速度十分重要。3.加入何種緩沖液重懸細胞核，取決于用戶后續(xù)的實驗。如做WB可用RIPA裂解緩沖液。4.進行WesternBlot和2D-膠電泳，可先用小體積的水重懸核沉淀，然后加入樣品緩沖液，如果直接用含SDS的緩沖液裂解核將釋放大量粘稠的DNA使樣品難以分散。反復(fù)加熱變性有助于DNA斷裂，可通過細針頭反復(fù)抽吸打斷DNA。免疫沉淀時可直接加入IP緩沖液。