G&VS10014.1 v.A

線粒體外膜功能檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

線粒體外膜功能檢測試劑是一種旨在通過細(xì)胞色素C氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在去垢劑存在與否的條件下，還原性細(xì)胞色素C氧化后吸光峰值的變化，即采用比色法測定樣品中酶活性，進(jìn)而評價(jià)線粒體外膜功能完整性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種純化線粒體（動物、人體、植物、昆蟲等）外膜功能完整性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase；COX；EC1.9.3.1）存在于真核生物的細(xì)胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量。作為線粒體外膜功能的生物標(biāo)記，通過測定在去垢劑（既使COX酶保持活性，又使外膜充分裂解）存在與否的條件下，線粒體的酶含量變化，來衡量線粒體外膜的完整性。通常，在線粒體的制備過程中，由于受到物理或化學(xué)的處理，導(dǎo)致線粒體的損傷，有的甚至高達(dá)40％以上。

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A） 毫升

反應(yīng)液（Reagent B） 毫升

穩(wěn)定液A（Reagent C1） 管

穩(wěn)定液B（Reagent C2） 微升

稀釋液（Reagent D）      毫升

裂解液（Reagent E） 微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

緩沖液（Reagent A）和稀釋液（Reagent D）保存在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent B）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制和樣品處理的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的穩(wěn)定液B（Reagent C2）置入冰槽里融化，然后移出xx微升到穩(wěn)定液A（Reagent C1）管里，混勻后，標(biāo)記為穩(wěn)定工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent B）置入冰槽里融化，移出150微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升穩(wěn)定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置至少15分鐘（可見顏色變化），置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液（注意：參見注意事項(xiàng)5），放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

一、 測讀準(zhǔn)備

1． 設(shè)定好分光光度儀：溫度25℃，波長550nm，間隔10秒，測讀7次（共60秒），并置零或設(shè)置0秒和60秒各測讀1次

2． 從－70℃冰箱里取出待測的純化線粒體樣品，置于冰槽里融化

3． 分別移出10微升待測樣品（注意：總量4微克/10微升；參見注意事項(xiàng)16）到2個新的1.5毫升離心管，置入冰槽中（注意：參見注意事項(xiàng)4）

4． 加入xx微升稀釋液（Reagent D）到其中1管離心管（稀釋液處理），混勻，即刻置入冰槽中

5． 加入xx微升裂解液 （Reagent E）到另一管離心管（去垢液處理），混勻，即刻置入冰槽中（注意：參見注意事項(xiàng)16）

6． 在冰槽中孵育15分鐘，等待測定

7． 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

二、 背景對照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的1毫升比色皿

2． 加入xx微升稀釋液（Reagent D）

3． 放進(jìn)分光光度儀，置零

4． 取出比色皿，加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent B）和穩(wěn)定液（Reagent C）的反應(yīng)工作液

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

6． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)）――

三、 樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升稀釋液（Reagent D）

3． 加入10微升上述稀釋液處理的待測樣品

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 放進(jìn)分光光度儀，置零

6． 取出比色皿，加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent B）和穩(wěn)定液（Reagent C）的反應(yīng)工作液

7． 即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為稀釋液處理樣品讀數(shù)（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)）――此讀數(shù)差值為正數(shù)，則表明樣品具有酶活性

9． 實(shí)際讀數(shù)：（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）即損傷線粒體釋放的細(xì)胞色素C氧化酶活性（COX）的實(shí)際讀數(shù) 

10． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至9，測定上述裂解液處理的待測樣品，此為總線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性（COX）的實(shí)際讀數(shù)

四、線粒體外膜功能完整性評價(jià)-——外膜完整百分率

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