武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司主營：動(dòng)植物,細(xì)菌,細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)
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間接標(biāo)記的方法中應(yīng)用了報(bào)告分子標(biāo)記的探針，報(bào)告分子通過親和酶促的方法進(jìn)行顯色。常用的報(bào)告分子如地高6辛，生物素。結(jié)合地高6辛抗6體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進(jìn)行間接的底物反應(yīng)檢測。地高6辛標(biāo)記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測時(shí)使用的地高6辛抗6體不會(huì)結(jié)合于其他的生物分子。這是相較于生物素標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。地高6辛抗6體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據(jù)不同的應(yīng)用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測結(jié)果。但需注意，由于引入了免6疫檢測反應(yīng)，在放大檢測靈敏度的同時(shí)，應(yīng)注意樣品內(nèi)源性酶的滅活，以降低檢測背景。

通過不同標(biāo)記方法的聯(lián)合應(yīng)用，還可在同一樣本中實(shí)現(xiàn)染色體不同區(qū)域或細(xì)胞樣本中不同RNA序列的多重檢測。

就DNA探針和RNA探針的比較，DNA探針在雜交過程中會(huì)出現(xiàn)探針雙鏈之間退火的可能，也更傾向于在溶液中形成大分子的探針聚合體，從而影響其滲透能力。而RNA 探針的應(yīng)用，將提高DNA-RNA雜交子的熱穩(wěn)定性。

Tips：RNA探針因其單鏈、高分子結(jié)合力、可適應(yīng)高溫雜交的特性，其檢測特異性和靈敏度均優(yōu)于DNA探針。常用的RNA探針標(biāo)記方法為構(gòu)建質(zhì)粒后進(jìn)行轉(zhuǎn)率合成。通過PCR擴(kuò)增的方法，可以更方便地進(jìn)行RNA探針的制備；RNA探針合成后，還需驗(yàn)證其對(duì)目標(biāo)片段檢測的靈敏度和特異性。

雜交技術(shù)zui重要的因素之一是選擇zui適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即zui適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對(duì)雜交的影響見表18-3。

zui適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)