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原位雜交中探針的選擇

DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針均能通過不同的酶促分子反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記。寡核苷酸探針的長度較短，因此避免了探針內(nèi)部退火的問題，在雜交時(shí)的滲透能力也更好，探針與靶標(biāo)的接觸這是影響原位雜交是否成功的重要因素之一。DNA探針、RNA探針在合成時(shí)需要控制探針片段長度，通常300-1000bp左右，能覆蓋到較長片段的靶核酸序列，增加檢測的靈敏度。

使用分支DNA信號(hào)擴(kuò)增的RNA FISH

Invitrogen? ViewRNA?和PrimeFlow?檢測是使用分支DNA信號(hào)擴(kuò)增 (bDNA) 來檢測特異性信號(hào)的直接熒光RNA ISH方法。 使用獨(dú)立但兼容的信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)讓RNA靶標(biāo)的多重復(fù)用成為可能。 熒光RNA原位雜交檢測分為四個(gè)主要步驟：樣本制備、靶標(biāo)雜交、信號(hào)擴(kuò)增以及檢測。 該方法可實(shí)現(xiàn)更高的特異性，更低的背景值和更高的信噪比。

在選擇探針類型的同時(shí)，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放0射性探針比非放0射性探針的靈敏度高。放0射性探針的實(shí)際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在檢測單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效0率0高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。