武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司主營(yíng)：動(dòng)植物,細(xì)菌,細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)

雜交技術(shù)zui重要的因素之一是選擇zui適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即zui適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對(duì)雜交的影響見表18-3。

zui適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)

總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗(yàn)，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放0射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。



在選擇探針類型的同時(shí)，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放0射性探針比非放0射性探針的靈敏度高。放0射性探針的實(shí)際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在檢測(cè)單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效0率0高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。