Caspase-3酶活性測(cè)定試劑盒 C1113

描述：

Caspase-3是凋亡過(guò)程中最主要的終末蛋白酶，也是研究最多的caspase；它激活pro-caspase-2,6,7,9，特異水解多種關(guān)鍵凋亡蛋白如PARP，介導(dǎo)染色質(zhì)固縮、凋亡小體生成、核DNA斷裂。測(cè)定原理基于Caspase-3特異水解多肽底物DEVD-pNA  (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide)，釋放的游離硝基苯胺pNA在405nm有最大吸光度。采用可見光光度比色法測(cè)定pNA而得到Caspase活性。適用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞Caspase-3活性。

組成 (所示為100次檢測(cè), 50次檢測(cè)試劑量減半)

1. 裂解緩沖液20ml, 4 oC

2. 反應(yīng)緩沖液10ml, 4 oC

3. 底物 0.5ml, -20 oC避光

4. 10mM pNA標(biāo)準(zhǔn)品0.2ml, -20 oC避光

試劑常溫運(yùn)輸，到達(dá)后按要求儲(chǔ)存，1年內(nèi)穩(wěn)定。

所需儀器：

可見光分光光度計(jì)配100μl比色杯，或酶標(biāo)儀。最佳波長(zhǎng)405nm，也可測(cè)OD400~450nm但靈敏度略降。

組織細(xì)胞準(zhǔn)備：

Caspase活性測(cè)定值低，最常見原因是未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少，其次是觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時(shí)，并非劑量越大時(shí)間越長(zhǎng)Caspase活性就越高。可設(shè)置不同劑量和時(shí)間點(diǎn)如0、2、4、8、16、24小時(shí)，以檢測(cè)最佳的觀察點(diǎn)。通常2×10⁷細(xì)胞或2mg組織裂解于1ml可產(chǎn)生1~3mg/ml蛋白。初次測(cè)定時(shí)，單個(gè)測(cè)定反應(yīng)可加~200μg蛋白物對(duì)應(yīng)于2×10⁶細(xì)胞或2個(gè)孔的6孔板細(xì)胞。最少，單個(gè)測(cè)定反應(yīng)需加20μg蛋白對(duì)應(yīng)于2×10⁵個(gè)細(xì)胞或2個(gè)孔的12孔板細(xì)胞。勿用絲氨酸蛋白酶抑制劑如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。

1. (1)細(xì)胞裂解：1000g 5分鐘收集細(xì)胞，吸盡上清。每2~10×10⁶細(xì)胞加50~100μl裂解液震蕩裂解，冰浴10分鐘，再次震蕩。(2)組織裂解：3~10mg組織加100 μl裂解液放入小型玻璃勻漿器，上下勻漿30次。轉(zhuǎn)移勻漿液于離心管。

2. 4 oC 12,000g 10分鐘，取上清測(cè)定，或-70 oC保存。

3. 蛋白定量：用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。裂解液含還原劑不宜采用BCA法。應(yīng)使蛋白濃度達(dá)到1-3 mg/ml，相當(dāng)于每10 μl待測(cè)樣品含10-30μg蛋白，否則應(yīng)增加細(xì)胞用量。

測(cè)定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線：

1. 用反應(yīng)緩沖液稀釋10mM pNA標(biāo)準(zhǔn)品為200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。設(shè)置不加pNA的零管。

2. 每一濃度取100 μl加入96孔板或100μl比色杯，測(cè)定405nm吸光度OD值。

3. 每一濃度標(biāo)準(zhǔn)管OD405值為x軸，對(duì)應(yīng)的pNA濃度為y軸，用Excel制作pNA濃度對(duì)OD405值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定操作：

1. 按下表設(shè)置96孔板反應(yīng)體系。底物最后加入以使各管反應(yīng)起始時(shí)間相同。設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照管。酶活力不足或過(guò)高，可增加或減少樣品。

2. 蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC反應(yīng)2小時(shí)，肉眼可見顏色變黃時(shí)的OD405值約為0.2，此時(shí)即可測(cè)定。顏色變化不明顯可延長(zhǎng)反應(yīng)或過(guò)夜，但酶活性較強(qiáng)時(shí)，孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。

3. 樣品管OD405減去空白對(duì)照OD405，為樣品Caspase水解底物產(chǎn)生的pNA吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，并以蛋白濃度校正之。

4. 測(cè)得的Caspase酶活性表示方法有兩種。(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 實(shí)驗(yàn)處理組OD / 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組OD，簡(jiǎn)單而可靠。(2)樣品Caspase酶活力單位/mg protein，精確但計(jì)算較復(fù)雜，參見說(shuō)明。

反應(yīng)體系參考表 (允許適當(dāng)調(diào)整樣品加樣量)

說(shuō)明：

1. Caspase酶活力單位定義：參考Chemicon公司One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 oC under saturated substrate concentrations。即當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí),一個(gè)Caspase酶活力單位定義為37 oC 1小時(shí)水解pNA底物，產(chǎn)生1nmol游離pNA。根據(jù)pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品OD值，可計(jì)算出Caspase酶活力單位。

2. 除了處理組外，可設(shè)置陽(yáng)性凋亡誘導(dǎo)劑組，陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)照可包括不具有凋亡誘導(dǎo)作用的試劑(如果能得到)處理組、溶劑對(duì)照組、或凋亡誘導(dǎo)零時(shí)間點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

1. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J. 326, 1-16 (1997).

2. Porter AG and Janicke RU. Emerging role of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ. 6, 99-104 (1999).