武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司
主營(yíng)產(chǎn)品: 檢測(cè)
上海染色體原位雜交-河北染色體原位雜交電話-思特進(jìn)
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經(jīng)營(yíng)模式
生產(chǎn)加工
所在地區(qū)
湖北省武漢市
主營(yíng)產(chǎn)品
原位雜交技術(shù)基本原理
原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列,將有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì),結(jié)合成專一的核酸雜交分子,經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。
為顯示特定的核酸序列必須具備3個(gè)重要條件:組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物。
原位雜交 (ISH) 是用于定位固定組織和細(xì)胞中特定核酸靶標(biāo)的強(qiáng)大技術(shù),能夠獲得與基因表達(dá)和遺傳位點(diǎn)相關(guān)的時(shí)間和空間信息。 雖然ISH的基本工作流程與印跡雜交近似,即核酸探針被合成、標(biāo)記、純化和特異性靶標(biāo)退火,但其不同之處在于前者可通過(guò)可視化顯示組織內(nèi)的結(jié)果來(lái)獲得更多信息。 如今有兩種基本方法來(lái)實(shí)現(xiàn)可視化顯示原位RNA和DNA靶標(biāo),即熒光 (FISH) 和顯色 (CISH) 檢測(cè)。 每種檢測(cè)方法本身的特點(diǎn)(見下表)使得FISH和CISH適用于截然不同的應(yīng)用。 雖然兩種方法均使用標(biāo)記的、與樣本雜交的靶標(biāo)特異性探針,但每種方法用于可視化顯示樣本的儀器不同。 這里我們將強(qiáng)調(diào)每種方法的不同之處和各自的優(yōu)勢(shì)。
武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司成立于2007年,是一家以實(shí)驗(yàn)技術(shù)研發(fā)、實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品研發(fā)、日化產(chǎn)品研發(fā)、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目承接為一體的高新技術(shù)公司;公司實(shí)驗(yàn)中心有分子生物學(xué)平臺(tái)、細(xì)胞平臺(tái)、光鏡平臺(tái)、植物組培平臺(tái)、原核蛋白表達(dá)平臺(tái)、日化產(chǎn)品生產(chǎn)平臺(tái);可以開展各類動(dòng)、植物、細(xì)菌、細(xì)胞等生物實(shí)驗(yàn)。
在條件都得到滿足的情況下,雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了,雜交反應(yīng)不完成;時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益,會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來(lái)計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度(Co)和 反應(yīng)時(shí)間(t)的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot =100時(shí),雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0,基本上沒(méi)有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400μg/ml(按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算,總的吸收值為 9.6),如果反應(yīng)時(shí)間為21h,那么對(duì)于未標(biāo)記的DNA來(lái)說(shuō),Cot =9.6/21 =100.8,,雜交完成了。對(duì)標(biāo)記DN A(濃度為0.1μg/ml)來(lái)說(shuō)Cot值為0.05,這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。Tm值25℃時(shí)雜交zui佳,所以首先要根據(jù)公式(4)計(jì)算雜交體Tm 值。由此式可見,通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性。