描述：考馬斯亮藍(lán)蛋白定量法又稱Bradford法，是最常用的蛋白質(zhì)快速定量方法之一。考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue G-250)與蛋白質(zhì)結(jié)合后染料的最大吸收峰由465nm變?yōu)?/span>595nm，溶液的顏色由棕色變?yōu)?/span>藍(lán)色，在595nm波長下測定的吸光度值與蛋白含量成正比。靈敏度比Lowry法高4倍，與BCA法相當(dāng)。反應(yīng)迅速，2分鐘達(dá)到平衡并在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。操作簡便，只需要一種反應(yīng)試劑。干擾物質(zhì)少，K⁺、Na⁺、Mg²⁺離子、Tris、葡萄糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、(NH₄)₂SO₄、乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。本試劑盒采用改良Bradford法和優(yōu)化的試劑組成以及優(yōu)化的測定方案，可對(duì)0.5-4000μg/ml濃度范圍的蛋白進(jìn)行線性檢測，顯著提高了蛋白檢測靈敏度。提供的5 ′ 染料濃縮液可進(jìn)行400次標(biāo)準(zhǔn)2ml比色杯檢測，或2666次微板檢測。

組成與儲(chǔ)存： 1)  5′Coomassie濃縮溶液 100ml 室溫或4oC儲(chǔ)存

2) 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA) 4.0mg/ml溶液 1ml ?20oC儲(chǔ)存

所需設(shè)備：比色計(jì)或酶標(biāo)儀、微板比色儀，工作波長為595nm±5nm (見說明1)。

操作步驟：

一、工作染液配制

用蒸餾水將5×Coomassie濃縮液稀釋為500ml 1×染料工作液。稀釋的1×染料工作液用普通濾紙過濾除去沉淀，否則可能無法使用。1×染料工作液在4oC避光保存9個(gè)月，放置后如由茶色變藍(lán)色可再次過濾。加入反應(yīng)管前應(yīng)升到室溫，直接使用4oC工作液不影響精度但測得的OD值較低。

二、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制

按照表1和下頁說明將標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA，4mg/ml，-20oC)稀釋為需要的濃度?？捎秒p蒸水、0.9%生理鹽水、PBS緩沖液或待測蛋白樣品的緩沖液稀釋。

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取8支干凈試管，按下表加樣。將試管中溶液充分混勻，放置2min。將溶液分別加入1 cm光徑的比色皿(或取200μl加入96孔微板)，用分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微板測量儀測定595 nm處的光吸收值OD595。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，用吸光度值OD595為縱坐標(biāo)作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定與濃度計(jì)算

樣品測定方法同上(標(biāo)準(zhǔn)曲線制作)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測出的未知樣品的OD595值，查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。此濃度是與染料工作液混合之前的待測樣品中的蛋白濃度。如果樣品在與染料工作液混合之前經(jīng)過稀釋，最后估計(jì)樣品蛋白濃度時(shí)須乘以實(shí)際稀釋倍數(shù)。

表1 幾種不同測定方案的加樣量和比例

標(biāo)準(zhǔn)測定：反應(yīng)終體積2ml。用1cm光程玻璃或塑料比色皿，用比色計(jì)測定。

微量測定：反應(yīng)終體積300μl。用96孔微板，用酶標(biāo)儀、微板比色儀測定。

標(biāo)準(zhǔn)方案(50-2000 μg/ml)標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)蛋白倍比稀釋:

標(biāo)準(zhǔn)測定時(shí)：30μl 4000μg/ml BSA + 30μl稀釋溶液(H₂O/PBS/0.9%NaCl) = 60μl (BSA=2000μg/ml)，取30μl連續(xù)倍比稀釋7次，得到BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/ml。每一稀釋度標(biāo)準(zhǔn)溶液各取20μl，與1980ml或者2000ml染料工作液混合。

微量測定時(shí)：5μl 4000μg/ml BSA + 5μl稀釋溶液(H₂O/PBS/0.9%NaCl) = 10μl (BSA=2000μg/ml)，取5μl連續(xù)倍比稀釋7次。得到BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/ml。每一稀釋度標(biāo)準(zhǔn)溶液各取3μl，與297或300 ml藍(lán)染料工作液混合。

高敏感方案(5-500μg/ml)標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)蛋白倍比稀釋:

標(biāo)準(zhǔn)測定時(shí)：37.5μl 4000 μg/ml BSA + 262.5μl稀釋溶液(H₂O/PBS/0.9%NaCl) = 300μl (BSA=500μg/ml)，取150μl連續(xù)倍比稀釋7次。得到BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液500、250、125、62.5、31.25、15.625 、7.813、3.907μg/ml。每一稀釋度標(biāo)準(zhǔn)溶液各取100 μl，與1800ml或者2000ml染料工作液混合。

微量測定時(shí)：3.75μl 4000μg/ml BSA + 26.25μl稀釋溶液(H₂O/PBS/0.9%NaCl) = 30μl (BSA=500μg/ml)，取15μl連續(xù)倍比稀釋7次。得到BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液500、250、125、62.5、31.25、15.625 、7.813、3.907μg/ml。每一稀釋度標(biāo)準(zhǔn)溶液各取15μl，與285ml或者300ml染料工作液混合。

超敏感方案(0.5-50μg/ml)標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)蛋白倍比稀釋

標(biāo)準(zhǔn)測定時(shí)：37.5μl 4000μg/ml BSA + 2962.5 μl稀釋溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 2000μl (BSA=50μg/ml)，取1000μl連續(xù)倍比稀釋7次。得到BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.782、0.391 μg/ml。每一稀釋度標(biāo)準(zhǔn)溶液各取1000 μl，與1000ml染料工作液混合。

微量測定時(shí)：3.75μl 4000μg/ml BSA + 296.25μl稀釋溶液(H₂O/PBS/0.9%NaCl) = 300μl (BSA=50μg/ml)，取150μl連續(xù)倍比稀釋7次。得到BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.782、0.391 μg/ml。每一稀釋度標(biāo)準(zhǔn)溶液各取150μl，與150ml染料工作液混合。

注意事項(xiàng)

1. 分別在工作波長為595nm和450nm測定OD值，計(jì)算OD594/OD450，以此代替原有的OD595作圖，可明顯提高檢測的精確度和靈敏度約10倍，顯著提高測定的線性關(guān)系，并降低去垢劑的影響。在進(jìn)行超敏感度測定時(shí)可考慮此法。

2. 主要干擾物質(zhì)的終濃度：SDS<0.002%；Triton X-100<0.1%；Tween-20/60/80<0.015%；NaOH<0.1N。

3. 蛋白-染料結(jié)合物在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，但在5-20分鐘內(nèi)穩(wěn)定性最好，因此應(yīng)盡快測定。如果放置過久將出現(xiàn)沉淀，或使測定結(jié)果偏低。

4. 染料不結(jié)合精氨酸、賴氨酸及分子量小于3kDa的短肽，所以不同的蛋白質(zhì)由于精氨酸和賴氨酸含量不同會(huì)出現(xiàn)小范圍的測量偏差；小于3kDa的短肽純品不能用此方法測定。

5. 染料-蛋白結(jié)合物附著在石英比色皿后難以洗去，因此不宜使用石英比色皿?？捎貌ＡЩ蛩芰媳壬?，用后立即用95%乙醇或洗滌劑浸泡洗滌。塑料比色皿不可用乙醇長時(shí)間浸泡。

6. 標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該每次新做。但每一稀釋度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品可預(yù)先配好-20oC凍存?zhèn)溆茫⒁庠谑褂眠@種非新鮮配制的BSA時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的某一些點(diǎn)偏差較大，說明稀釋的BSA已經(jīng)壞掉應(yīng)予重配。

7. Bradford法物質(zhì)干擾及耐受的最大濃度參見公司網(wǎng)站pdf文件。