描述：液體樣本總谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒是一種簡易的利用紫外比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性的試劑盒。GPx包括含硒和不含硒的兩類，絕大部分細胞內(nèi)的GPx是含硒的。本試劑盒檢測的是含硒和不含硒的總GPx。試劑盒檢測GPx線性范圍為31-1000mU/ml，靈敏度≤31mU/ml。

規(guī)格：100次

儲存：按說明書要求儲存，12個月有效    

操作步驟：

1. 樣品的準(zhǔn)備

血漿樣品或紅細胞裂解液的準(zhǔn)備：取新鮮抗凝血至少0.5ml，4℃,1000g離心5分鐘，上清為血漿。對于沉淀中紅細胞，利用冰冷PBS洗滌3次。取約5倍紅細胞體積的冰冷的純水，重懸細胞沉淀，冰浴10分鐘。4℃，10000g離心10分鐘。取上清進行蛋白濃度定量后用于谷胱甘肽過氧化物酶的測定。不立即測定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活性超出測定范圍，可利用樣品稀釋液適當(dāng)稀釋后測定，稀釋倍數(shù)請通過預(yù)實驗確定。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備

2.1 GSH儲備液的配制：在本試劑盒提供的12 mg GSH中加入1ml的純水，溶解并混勻，即為GSH儲備液，濃度為40 mM。

2.2 NADPH儲備液的配制：在本試劑盒提供的15mg NADPH中加入0.9ml純水，溶解并混勻，即為NADPH儲備液，濃度為20 mM。

2.3谷胱甘肽過氧化物酶檢測工作液的配制：根據(jù)待測樣品數(shù)配制適當(dāng)量的谷胱甘肽過氧化物酶檢測工作液，表中試劑按比例混合后即為谷胱甘肽過氧化物酶檢測工作液。

2.4過氧化物工作液的配制：取30 μl過氧化物試劑（Cum-OOH）加入5ml純水中，混勻，然后根據(jù)需要量取部分Cum-OOH水溶液，用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液稀釋10倍，即為過氧化物工作液。

注：稀釋過的過氧化物水溶液和過氧化物工作液冰浴保存請勿超過6 h。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

將20mM的NADPH儲備液用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液稀釋成500、250、125、62.5、31.2、15.6 μM濃度的NADPH溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。在本試劑盒相同反應(yīng)體系下NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線只需要測定1次。

4. 測定方法

4.1   NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：利用上述系列濃度NADPH標(biāo)準(zhǔn)品，各取200μl到96孔板中，各孔加入NADPH量分別為100、50、25、12.5、6.2、3.1 nM，測定A_340nm。

4.2   使用96孔板，依次加入谷胱甘肽還原酶檢測工作液、樣品后，混勻，25℃或室溫孵育2分鐘。

4.3各孔加入過氧化物工作液50μl，25℃孵育20分鐘，注意縮短樣品之間加入NADPH的時間間隔（盡量使用多道移液器）。

4.4各孔加入過氧化物工作液50μl啟動谷胱甘肽過氧化物酶反應(yīng)后，立即開始計時，并在2.5、5、10、20分鐘等時間點測定A_340nm。如果樣品吸光度下降過快，可適度稀釋樣品后測定；如果樣品吸光度下降過慢，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間進行樣品測定。

5. 數(shù)據(jù)處理

利用NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得橫縱坐標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式，然后利用標(biāo)曲和各樣品的吸光度值計算樣品中剩余的NADPH量，從而換算為谷胱甘肽過氧化物酶活力（注意精確計時）。由于有多個時間點的測定，可以選擇時間線性良好的時間段計算谷胱甘肽過氧化物酶活力。

谷胱甘肽過氧化物酶定義：在25℃，pH 7.2條件下，每分鐘將1.0μmol的還原型谷胱甘肽氧化為氧化型谷胱甘肽的谷胱甘肽過氧化物酶為1 U，1 U=1000 mU。

計算公式：酶活力(mU)=NADPH生成量（nmol）*2/反應(yīng)時間(min)。