常溫運(yùn)輸，4oC 1年穩(wěn)定，－20oC長(zhǎng)期保存。

描述：CHO細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell)，為上皮樣細(xì)胞，通常貼壁生長(zhǎng)、也可懸浮生長(zhǎng)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、抗體研究、藥物開發(fā)等生物科研領(lǐng)域。本轉(zhuǎn)染試劑適用于多種CHO細(xì)胞的亞型。

自備試劑：無(wú)菌150mM NaCl即0.9%生理鹽水或無(wú)菌蒸餾水或PBS緩沖液，用于離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染制備轉(zhuǎn)染混合物。5%無(wú)菌葡萄糖，用于離體或在體轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染混合物制備。與復(fù)合物顆粒形成有關(guān)，勿用其它緩沖液替代。

DNA、siRNA和寡聚核苷酸：建議溶于滅菌蒸餾水。質(zhì)粒DNA高純度OD260/280 ~1.8，無(wú)內(nèi)毒素。可用內(nèi)毒素清除劑(#D1501)清除內(nèi)毒素。寡聚核苷酸和用于RNA干擾(siRNA)的核苷酸，可單獨(dú)或與質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染，但必須使用經(jīng)HPLC或凝膠洗脫純化去除雜鏈的高純度片段。siRNA和寡聚核苷酸與DNA轉(zhuǎn)染及優(yōu)化操作相似，但對(duì)其用量進(jìn)行細(xì)致的優(yōu)化很重要。

細(xì)胞準(zhǔn)備（重要!）

接種細(xì)胞數(shù)：參見(jiàn)附表細(xì)胞計(jì)數(shù)接種。培養(yǎng)時(shí)間：轉(zhuǎn)染前應(yīng)培養(yǎng)~24h，使之處于分裂和旺盛生長(zhǎng)期。細(xì)胞密度與轉(zhuǎn)染時(shí)機(jī)：培養(yǎng)~24h后，細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿表面積的70~90%時(shí)為轉(zhuǎn)染最佳時(shí)機(jī)。低密度細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率并不低，但總細(xì)胞數(shù)少因而蛋白表達(dá)總量也不會(huì)很高。在較高細(xì)胞密度時(shí)轉(zhuǎn)染較好，但100%長(zhǎng)滿的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很低，因此接種細(xì)胞要均勻，以減少因局部緊密接觸而致生長(zhǎng)抑制的難轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則最好重頭接種細(xì)胞。CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑允許在細(xì)胞鋪板時(shí)或鋪板后立即轉(zhuǎn)染，效果與貼壁后轉(zhuǎn)染相似，但大大節(jié)省時(shí)間和勞動(dòng)，適合高通量篩選。甚至一些難轉(zhuǎn)染細(xì)胞也可嘗試此即時(shí)轉(zhuǎn)染方法。血清和培養(yǎng)基：血清和抗生素不影響轉(zhuǎn)染，在10~30%血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染表達(dá)效率更高。轉(zhuǎn)染混合物體積為培養(yǎng)基的1/10，參見(jiàn)表第5欄。如果培養(yǎng)基未明顯變黃，轉(zhuǎn)染前可不更換。如轉(zhuǎn)染結(jié)果滿意，轉(zhuǎn)染后無(wú)需更換培養(yǎng)基。但轉(zhuǎn)染混合物稀釋了培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4~8小時(shí)后換培養(yǎng)基會(huì)可進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)染效率。

CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑和DNA用量及優(yōu)化

任何轉(zhuǎn)染和優(yōu)化方案需考慮轉(zhuǎn)染試劑量、DNA量、但關(guān)鍵是二者所帶的電荷比charge ratio簡(jiǎn)稱R，即轉(zhuǎn)染試劑所帶正電荷基團(tuán)相對(duì)于核酸負(fù)電荷磷酸基團(tuán)的當(dāng)量比率。通常R>3時(shí)DNA復(fù)合物帶正電荷可被轉(zhuǎn)染。在操作上，R值規(guī)定了二者的用量比例，適宜的R值因細(xì)胞類型和細(xì)胞密度而異。對(duì)于離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑用量和R值的計(jì)算公式如下：

CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑體積μl=0.4×R×DNAμg數(shù)

R=2.5×CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑體積μl?DNAμg數(shù)

初次轉(zhuǎn)染推薦設(shè)定R=6或8(附表灰色欄)在24孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染優(yōu)化，確定最佳轉(zhuǎn)染方案。在DNA量固定時(shí)，對(duì)R值的優(yōu)化相當(dāng)于優(yōu)化試劑用量，建議設(shè)定R=5、7、9或者6、8、10三檔。確定轉(zhuǎn)染效率最高的R值后，再優(yōu)化DNA用量。附表建議的DNA量已接近所列細(xì)胞數(shù)的中上限，但仍可~50%增減；也可根據(jù)實(shí)際情況在較大范圍增減DNA用量(0.5~5μg DNA/1×10⁵細(xì)胞)，再按公式計(jì)算轉(zhuǎn)染試劑用量。CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑在R<15時(shí)幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，因而無(wú)需為降低毒性而優(yōu)化。

貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染 (以24孔板為例，參見(jiàn)表一)

1. 參見(jiàn)表一第4、5欄。將1μg DNA稀釋于100μl無(wú)菌生理鹽水或無(wú)菌蒸餾水或PBS緩沖液(自備，勿用其它緩沖液但可用5%葡萄糖代替)，可振蕩混勻。

2. 取2.4μl CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑加至DNA溶液，勿用相反的加樣順序。立即振蕩混勻，低速瞬時(shí)離心將液體甩至管底。

3. 室溫放置15分鐘。

4. 將100μl轉(zhuǎn)染混合物直接加至1ml含血清培養(yǎng)基中(參見(jiàn)表一最右欄)，傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板混勻。轉(zhuǎn)染前可不更換培養(yǎng)基。

5. 培養(yǎng)24~48小時(shí)檢測(cè)基因表達(dá)，或1:10傳代后加抗生素篩選。轉(zhuǎn)染后無(wú)需更換培養(yǎng)基。但轉(zhuǎn)染混合物稀釋了培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4~8小時(shí)后換培養(yǎng)基可進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)染效率。

表一 CHO轉(zhuǎn)染試劑與貼壁細(xì)胞加樣和優(yōu)化表

注計(jì)算公式：CHO轉(zhuǎn)染試劑體積μl = 0.4 × R × DNA μg數(shù)

貼壁細(xì)胞在鋪板時(shí)轉(zhuǎn)染、或鋪板后立即轉(zhuǎn)染

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：用含血清培養(yǎng)基洗滌消化的細(xì)胞，去除消化酶。用含血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞量稍大些，以轉(zhuǎn)染后24h細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%，或轉(zhuǎn)染48h內(nèi)完全長(zhǎng)滿為宜。

2. 制備轉(zhuǎn)染混合物，參照表一和上述貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟。

3. 鋪板后立即轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)皿中，然后立即加入CHO轉(zhuǎn)染試劑-DNA轉(zhuǎn)染混合物，混勻。

4. 鋪板的同時(shí)轉(zhuǎn)染：將CHO轉(zhuǎn)染試劑-DNA轉(zhuǎn)染混合物預(yù)先加到培養(yǎng)皿中，然后立即加入細(xì)胞懸液。

5. 培養(yǎng)24~48小時(shí)檢測(cè)基因表達(dá)。

懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染

以24孔板為例。

1. 按照表二準(zhǔn)備細(xì)胞和DNA。使用含血清培養(yǎng)基。通常懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染CHO轉(zhuǎn)染試劑和DNA用量比貼壁細(xì)胞要大。初始轉(zhuǎn)染推薦R=6，隨后可根據(jù)轉(zhuǎn)染效率設(shè)R=6、7、8、9、10優(yōu)化。注意轉(zhuǎn)染DNA量參見(jiàn)表二適當(dāng)再增加約30%并設(shè)R=8按公式計(jì)算試劑量。

2. 懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染：參見(jiàn)貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法制備轉(zhuǎn)染試劑和DNA混合物，室溫放置20分鐘后直接加至1ml含血清培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液中。培養(yǎng)24~48小時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表二 CHO轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞加樣和優(yōu)化表