描述：Hifectin I真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑由陽離子脂質(zhì)體和輔助脂質(zhì)以特定比例融合制備而成的單層脂質(zhì)體懸液，可與DNA或RNA形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，并將核酸釋放入細(xì)胞內(nèi)。Hifectin I獨(dú)特的制備方法增加了脂質(zhì)體對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的高效性、廣譜性、低毒性和可靠性，并使試劑在4°C儲(chǔ)存至少穩(wěn)定12個(gè)月。Hifectin I可高效轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞，屬于可被生物降解的脂質(zhì)體因而細(xì)胞毒性明顯降低，轉(zhuǎn)染效率與Invitrogen的LipofectAMINE相當(dāng)，但其價(jià)格僅相當(dāng)同類試劑的1/3。

轉(zhuǎn)染時(shí)只需將Hifectin I稀釋與DNA溶液混合并室溫放置15分鐘即可轉(zhuǎn)染細(xì)胞。1 ml Hifectin I 可轉(zhuǎn)染100-500μg DNA或50-100只35mm培養(yǎng)皿或250-1000孔24孔板細(xì)胞。

顏色：清亮或略呈白色膠體溶液。

儲(chǔ)存：4°C儲(chǔ)存12個(gè)月。切勿凍存。

適用：將DNA、RNA、寡聚核苷酸轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞。適用于大多數(shù)傳代或原代細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染步驟：

以生長(zhǎng)于24孔板的一個(gè)孔內(nèi)的貼壁細(xì)胞為例，使用其它規(guī)格培養(yǎng)皿參見表一。

細(xì)胞準(zhǔn)備：

轉(zhuǎn)染前一天傳0.5-2 x 10⁵細(xì)胞于24孔板內(nèi)，加1 ml正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。在光鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞群覆蓋培養(yǎng)瓶皿生長(zhǎng)表面的 85-95%時(shí)，為Hifectin I轉(zhuǎn)染的最佳時(shí)機(jī)。這通常需要18-24小時(shí)，但依細(xì)胞類型和接種量而變。注意：傳代時(shí)接種過多的細(xì)胞，100%長(zhǎng)滿的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率明顯降低

制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物：

對(duì)特定細(xì)胞類型來說，應(yīng)該優(yōu)化加入DNA (μg)和Hifectin I (μl)比率和絕對(duì)量，參見后面附表。推薦DNA和Hifectin I的初始比例為1:4。

DNA (μg) ：Hifectin I (μl) ＝ 1:2～1:8

轉(zhuǎn)染實(shí)際上是人為造成細(xì)胞對(duì)外源物質(zhì)的高攝取狀態(tài)，因此過量攝入DNA和轉(zhuǎn)染試劑將導(dǎo)致細(xì)胞毒性而降低轉(zhuǎn)染效率。與細(xì)胞接觸的轉(zhuǎn)染混合物中Hifectin I 的最大濃度不應(yīng)超過30 μl/ml，DNA濃度應(yīng)小于5μg/ml。參考表一制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，參照表二進(jìn)行優(yōu)化。下面的步驟以生長(zhǎng)于24孔板的單孔貼壁細(xì)胞為例。懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染參見表一后面的說明。

1. 取1 μg DNA稀釋到25 μl 無血清無抗生素培養(yǎng)基，混勻。

2. 取2-8 μl Hifectin I 加入到25 μl 無血清抗生素培養(yǎng)基，輕輕混勻。

3. 吸取稀釋的DNA溶液加入到稀釋的Hifectin I溶液中，上下吹吸混勻，勿振蕩。室溫孵育15分鐘。

如果按照相反的順序?qū)⑾♂尩腍ifectin I溶液與DNA混合，將生成相反類型的DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物，有可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降。

4. 在此期間用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，按照表一Step 5加入適宜體積的無血清無抗生素培養(yǎng)基。

5. 加入步驟3獲得的轉(zhuǎn)染復(fù)合物于培養(yǎng)瓶皿內(nèi)，輕輕混合與細(xì)胞充分接觸，開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

6. 二氧化碳孵箱37C孵育細(xì)胞4小時(shí)。

7. 吸除轉(zhuǎn)染混合物，加入含血清的正常培養(yǎng)基；或直接將含血清培養(yǎng)基加到孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)以上。觀察細(xì)胞，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。或1:10稀釋傳代，進(jìn)行G418篩選。

表一  DNA和轉(zhuǎn)染試劑稀釋表

懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染

懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染與上述步驟類似：(1) 離心收取細(xì)胞，用不含血清培養(yǎng)基洗滌2次；將1 x 10⁶ 細(xì)胞混懸于1ml無血清培養(yǎng)基，加入6孔板內(nèi)。(2) 按照表一制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加到懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。(3) 二氧化碳孵箱培養(yǎng)4小時(shí)。(4) 吸除轉(zhuǎn)染混合物，換常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)以上。觀察細(xì)胞或進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)如G418篩選。

轉(zhuǎn)染優(yōu)化程序：

對(duì)特定類型的細(xì)胞，欲獲得最大轉(zhuǎn)染效率和最低細(xì)胞毒性，應(yīng)該對(duì)加入DNA和Hifectin I的絕對(duì)量和比率、濃度等分別進(jìn)行優(yōu)化，步驟參見表二。表二是生長(zhǎng)于24孔板的單孔細(xì)胞為例進(jìn)行優(yōu)化操作的。由于可以理解的心理因素，實(shí)驗(yàn)人員在轉(zhuǎn)染時(shí)常常趨于加入過量的DNA和轉(zhuǎn)染試劑和使用更小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物體積。從表二可以計(jì)算，如果每孔加入1 μg DNA和8 μl Hifectin I，在200 μl轉(zhuǎn)染混合物中，DNA的濃度將為5μg/ml，Hifectin I濃度達(dá)到40μl/ml，二者的濃度很容易產(chǎn)生細(xì)胞毒性；另外轉(zhuǎn)染混合物體積很少時(shí)不利于操作也不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，不利于獲得最佳轉(zhuǎn)染效率。作為參考，通常最后的轉(zhuǎn)染混合物中DNA濃度應(yīng)小于5μg/ml，Hifectin I濃度應(yīng)<30～40 μl/ml。表二給出DNA和轉(zhuǎn)染試劑的量、比率、濃度等指標(biāo)僅作為參考。

表二 轉(zhuǎn)染優(yōu)化操作程序

1. 優(yōu)化DNA:Hifectin I 比率，固定加入0.5 μg DNA

DNA : Hifectin I  ratio                          1:1              1:2              1:3              1:4              1:5              1:6

DNA μg in 25 μl                                  0.5              0.5              0.5              0.5              0.5              0.5

Hifectin I  μl in 25 μl                             0.5              1                 1.5              2                 2.5              3

Add media μl                                       150              150              150              150              150              150

Final volume μl                                     200              200              200              200              200              200

Final DNA concentration μg/ml               2.5              2.5              2.5              2.5              2.5              2.5

Final Hifectin I  concentration μl/ml       2.5              5                 7.5              10               12.5             15

2. 優(yōu)化DNA和Hifectin I 絕對(duì)劑量，固定DNA:Hifectin I 比率為1:3或1:4

DNA : Hifectin I  ratio                          1:3              1:3              1:3              1:3              1:3

DNA μg in 25 μl                                  0.2              0.4              0.8              1.2              1.6

Hifectin I  μl in 25 μl                            0.6              1.2              2.4              3.6              4.8

Add media μl                                       150              150              150              150              150

Final volume μl                                    200              200              200              200              200

Final DNA concentration μg/ml               1                 2                 4                 6                 8

Final Hifectin I  concentration μl/ml       3                 6                 12               18               24

3. 優(yōu)化DNA和Hifectin I 濃度，固定DNA和Hifectin I 絕對(duì)量和比率為1:3或1:4

DNA : Hifectin I  ratio                          1:3              1:3              1:3              1:3              1:3

DNA μg in 25 μl                                  1                 1                 1                 1                 1

Hifectin I  μl in 25 μl                             3                 3                 3                 3                 3

Add media μl                                       100              150              200              250              300

Final volume μl                                    150              200              250              300              350

Final DNA concentration μg/ml               6.7              5                 4                 3.3              2.85

Final Hifectin I  concentration μl/ml         20               15               12               10               8.5

說明：

使用高純水和不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA、溶液、器皿。常規(guī)方法制備的質(zhì)粒DNA含有大量?jī)?nèi)毒素，可明顯降低降低轉(zhuǎn)染效率。使用內(nèi)毒素清除劑 (Endotoxin Removal Reagent) #D1501清除內(nèi)毒素。