描述：Hifectin II是特殊修飾的聚乙烯亞胺(polyethylenimine)陽離子聚合物，與核酸結(jié)合形成復合物吸附于細胞 膜表面后內(nèi)吞入胞。在細胞內(nèi)Hifectin II通過質(zhì)子海綿效應緩沖內(nèi)吞小體pH保護核酸免受降解，介導其轉(zhuǎn)運板的同時或鋪板后后立即轉(zhuǎn)染，其卓越的in vitro和in v到胞漿胞核高效表達。Hifectin II允許有血清轉(zhuǎn)染，在細胞鋪ivo轉(zhuǎn)染能力堪比jetPEI、Lipofectamine 2000、ExGen 500、FuGENE、SuperFect、Polyfect等轉(zhuǎn)染試劑，而且在多數(shù)細胞或組織器官的表達更佳。

Hifectin II具有寬泛的細胞廣譜性，高效轉(zhuǎn)染的在細胞有A497, A549,BHK,Caco-2, C-26, C2C12, C3H/10T, CHO, COS1, COS7, Sf9, HeLa, HEK293, HT-29, MCF7, NIH3T3, Jurkat, K562, RAW264.7, THP1, U937, PC12, L929, 5HSY-5Y, Vero,原代神經(jīng)元、原代肝細胞、皮膚成纖維細胞、臍靜脈內(nèi)皮細胞、人單核/巨噬細胞、牛和人血管內(nèi)皮細胞、人胚胎干細胞等。Hifectin II具有優(yōu)異的動物在體轉(zhuǎn)染能力，介導基因在心肺腎肝脾等各種組織高效表達。

特征：

2  有血清轉(zhuǎn)染，可在細胞鋪板前后立即轉(zhuǎn)染

2  媲美Lipofectamine 2000, jetPEI, FuGENE等，毒性低

2  高效轉(zhuǎn)染siRNA、DNA、寡聚核苷酸

2  in vitro轉(zhuǎn)染細胞譜廣，各種原代細胞和神經(jīng)元

2  in vivo動物轉(zhuǎn)染，心肺腎肝脾等高效表達

質(zhì)粒DNA質(zhì)量：質(zhì)粒高純度OD260/280~1.8無內(nèi)毒素?？捎脙?nèi)毒素清除劑(#D1501)清除內(nèi)毒素。

細胞準備：培養(yǎng)24h后，細胞胞體覆蓋培養(yǎng)皿表面的50~90%時均可轉(zhuǎn)染，但我們推薦較高細胞密度~80%轉(zhuǎn)染為佳。原代細胞應控制在培養(yǎng)48h后細胞密度達到~80%時轉(zhuǎn)染。細胞密度低時陽性轉(zhuǎn)染率并不低但毒性可能較明顯，而且因細胞總數(shù)少蛋白表達量不會很高。100%長滿的細胞轉(zhuǎn)化效率明顯降低。如果表一或表二所列的volume of medium減半，且在轉(zhuǎn)染4~8小時后換培養(yǎng)基，可進一步改善轉(zhuǎn)染效率。細胞生長在10%血清培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染效果會更好。

Hifectin II具有卓越的轉(zhuǎn)染能力，允許細胞在鋪板時或鋪板后立即加入混合好的Hifectin II-DNA轉(zhuǎn)染混合物，效果與貼壁后轉(zhuǎn)染相似，但節(jié)省時間，適合高通量篩選。

優(yōu)化原則:不同類型的細胞對轉(zhuǎn)染試劑和外源DNA的敏感性不同，同一細胞生長密度低時毒性會較明顯。很多細胞按照列表推薦即可獲得滿意的結(jié)果，但一些細胞需要優(yōu)化，目的是在無毒或低毒時獲得最佳轉(zhuǎn)染效率，且轉(zhuǎn)染試劑和DNA用量最少。原則上，幾乎所有轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化必須考慮的參數(shù)是N/P ratio，即轉(zhuǎn)染試劑的正電荷基團可中和核酸的負電荷磷酸基團的摩爾比率。在DNA量固定時，提高N/P值意味著增加轉(zhuǎn)染試劑的量，可增加轉(zhuǎn)染效率，但也會逐漸增加細胞毒性。

優(yōu)化操作：附表推薦的DNA量已經(jīng)接近所列培養(yǎng)皿和細胞數(shù)的上限，一般無需增加。初次轉(zhuǎn)染推薦N/P ratio=10 (附表灰色欄)。優(yōu)化可在24孔板進行，可設定N/P ratio為5、6、7、8、9、10、11、12等，參考附表推薦的DNA量，按公式計算Hifectin II用量：

μl Hifectin II = 0.3 × NP ratio × μg DNA

以24孔板1 μg DNA為例，每增減1個N/P ratio意味著Hifectin II用量增減0.3 μl。siRNA和寡聚核苷酸的優(yōu)化同上。

貼壁細胞轉(zhuǎn)染 (#C1506，以24孔板為例，參見表一)

1.  稀釋1μg DNA于100μl生理鹽水(自備，勿用其它替代)，混勻。

2.  取3.2μl Hifectin II加至DNA溶液(加樣順序勿相反，否則降低轉(zhuǎn)染效率)，立即振蕩混勻，瞬時離心將液體甩至管底。

3.  室溫放置15分鐘。

4.  將100μl轉(zhuǎn)染混合物直接加至1ml含10%血清的完全培養(yǎng)基中。傾斜轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板混勻。含血清培養(yǎng)基能提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前無需更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基體積為轉(zhuǎn)染混合物的10倍。

5.  培養(yǎng)24~48小時，檢測基因表達，或1:10傳代后加抗生素篩選。如果轉(zhuǎn)染效率滿意，轉(zhuǎn)染后可不更換培養(yǎng)基，但因轉(zhuǎn)染混合物稀釋了培養(yǎng)基，也可轉(zhuǎn)染4~8h后更換。

表一 Hifectin II貼壁細胞加樣和優(yōu)化表

注：傳代巨噬細胞如RAW 264.7的DNA量參照表一加倍例如每一24孔用2μg DNA，設N/P ratio=10。但原代巨噬細胞DNA量參照表一減半，設定N/P ratio=8，按公式計算轉(zhuǎn)染試劑用量：

μl Hifectin II = 0.3 × NP ratio × μg DNA

貼壁細胞在鋪板時轉(zhuǎn)染、或鋪板后立即轉(zhuǎn)染

操作要點是：(1)用含血清的完全培養(yǎng)基洗滌消化的細胞，以去除消化酶。(2)用含血清的培養(yǎng)基制備鋪板用的細胞懸液，細胞量要稍大些，以轉(zhuǎn)染后24h細胞長80~90%滿，或轉(zhuǎn)染后48h細胞完全長滿為宜。(3)參照貼壁細胞轉(zhuǎn)染步驟和表1制備Hifectin II-DNA轉(zhuǎn)染混合物。(4a)鋪板后立即轉(zhuǎn)染：將細胞懸液加到培養(yǎng)皿中，然后立即加入Hifectin II-DNA轉(zhuǎn)染混合物，混合均勻?；蛘?4b)鋪板的同時轉(zhuǎn)染：將Hifectin II-DNA轉(zhuǎn)染混合物預先加到培養(yǎng)皿中，然后立即加入細胞懸液。(5)培養(yǎng)24~48小時檢測基因表達。如果轉(zhuǎn)染效率滿意，轉(zhuǎn)染后可不更換培養(yǎng)基，但因加入轉(zhuǎn)染混合物導致培養(yǎng)基稀釋，轉(zhuǎn)染4~8h后更換培養(yǎng)基可使細胞生長更好。

懸浮細胞轉(zhuǎn)染 (#C1505)

以24孔板Jurkat淋巴細胞、K562為例。按照表二準備細胞和DNA。初始轉(zhuǎn)染推薦N/P=10，隨后可根據(jù)轉(zhuǎn)染效率或細胞毒性設置N/P=8、10、12優(yōu)化，按公式計算相應Hifectin II的量。注意Daudi和Molt 4轉(zhuǎn)染DNA的量參見表二適當再增加30%，然后按照N/P=10計算所需Hifectin II的量。

懸浮細胞轉(zhuǎn)染：參見貼壁細胞轉(zhuǎn)染方法制備轉(zhuǎn)染試劑和DNA混合物，室溫放置20分鐘后直接加至1ml含10%血清培養(yǎng)基的細胞懸液中。培養(yǎng)24~48小時進行后續(xù)實驗。

表二 Hifectin II懸浮細胞加樣和優(yōu)化表

注：計算公式 μl of Hifectin II = 0.3 × NP ratio × μg DNA

動物in vivo轉(zhuǎn)染 (#C1505-1)

DNA、siRNA、寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染和優(yōu)化相同。推薦初試轉(zhuǎn)染N/P=10。按公式計算Hifectin II用量：

μl of Hifectin II = 0.02 × NP ratio × μg of DNA

表三 動物in vivo轉(zhuǎn)染DNA和Hifectin II用量 (N/P=8)

表四 動物in vivo轉(zhuǎn)染參照表

小鼠總量DNA在50-75μg之間較好，>50μg表達增加不明顯但毒性增加，超過100μg部分動物可能死亡。注射混合物中DNA濃度應<0.5μg/ml。由于離子強度影響復合物形成，DNA和Hifectin II稀釋于5%葡萄糖溶液的效果比稀釋于生理鹽水好。另外有研究認為小鼠靜脈注射用400μl體積最佳。