描述：凋亡(apoptosis)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體，染色質(zhì)斷裂形成許多長度約為n x 180bp (n=1,2,3,4…)的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳顯示為階梯狀凋亡DNA Ladder，是細(xì)胞凋亡晚期無可爭辯的特征。本試劑盒能夠選擇性地分離和提取凋亡組織細(xì)胞特有的DNA ladder，快速方便，無需有機(jī)抽提，檢測靈敏度極高?？梢詮?000個凋亡細(xì)胞中檢測到DNA ladder，實(shí)驗(yàn)靈敏度實(shí)際上只受限于DNA凝膠染色如溴化乙錠染色的靈敏度。推薦起始標(biāo)本約1-10 x 10⁵ 個細(xì)胞，其中應(yīng)含有至少1-2 x10⁴個凋亡細(xì)胞；大于2 x10⁴個凋亡細(xì)胞通?？梢垣@得十分清晰的凋亡DNA ladder。據(jù)此，如果細(xì)胞凋亡發(fā)生率為10%，用戶可用六孔板的一個孔(相當(dāng)于一個35 mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)1-10 x 10⁵個細(xì)胞，如果內(nèi)含1-10 x 10⁴個凋亡細(xì)胞，應(yīng)足以獲得清晰的凋亡DNA ladder。

本試劑盒既可用于從培養(yǎng)細(xì)胞中提取提取凋亡DNA ladder，也可用于組織。但與培養(yǎng)細(xì)胞相比，整體動物組織凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的部位不定、規(guī)律性差，取材量和部位是否恰當(dāng)，均顯著影響最終DNA ladder的量。有豐富經(jīng)驗(yàn)的用戶可以使用本試劑盒從組織提取凋亡DNA ladder。

組成：溶液 A, B, C, D, E。

儲存：分別將各組分儲存于4 oC或－20 oC。

適用：從細(xì)胞或組織塊中提取凋亡DNA Ladder。25/50 assays。

提取步驟：

自備10%SDS，95-100% ethanol。1-10 x 10⁵個正常細(xì)胞，含有至少約1-2 x10⁴、最好有大于2 x10⁴凋亡細(xì)胞。

1.      PBS洗滌細(xì)胞。微型離心機(jī)5000 rpm 4oC 5 min收集細(xì)胞。棄上清吸除管壁附著液體。

2.      按比例每1-10 x 10⁵個細(xì)胞加入100 ml 溶液A，冰上10 min。振蕩30秒。5000 rpm 4 oC離心10分鐘。勿觸動管底沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管。

3.      加入10ml 自備的10% SDS于上清液，至終濃度為1%。

4.      加入2 ml 溶液B，混勻。37 oC 1小時?？裳娱L至2小時。

5.      加入2 ml 溶液C，混勻。37 oC 2小時?？裳娱L至4小時。

6.      加入1 ml 溶液D，混勻。

7.      加10 ml (1/10 vol.) 溶液E，加250ml (~2.5 vol.)乙醇，混勻。－20 oC孵育30分鐘。

8.      12000rpm 4C離心10min。棄上清，盡量吸除管壁附著液體。敞開管口，室溫干燥沉淀。

9.      用17ml雙蒸水溶解沉淀，加3 ml 6 x DNA凝膠上樣緩沖液，震蕩。如沉淀不溶可用槍頭搗碎，50-90 oC加熱10min然后高速離心。取全部20ml上清上樣1% agarose gel電泳。溴化乙錠染色紫外觀察。

說明：

1.      靈敏度實(shí)際上只受限于DNA凝膠染色如溴化乙錠染色靈敏度。采用高質(zhì)量、較薄的瓊脂糖凝膠和窄小的加樣孔，或用更敏感的凝膠DNA熒光檢測方法有助于增加DNA條帶觀察的靈敏度。

2.      必須注意只有晚期或嚴(yán)重的凋亡細(xì)胞才有l(wèi)adder。由于本試劑盒僅特異提取凋亡DNA ladder，如果凝膠上沒有出現(xiàn)DNA ladder通常表明細(xì)胞沒有發(fā)生凋亡，或者有凋亡發(fā)生但尚未出現(xiàn)DNA斷裂，此時增加細(xì)胞用量也難以湊效。本試劑盒可以從1000個凋亡細(xì)胞中檢測到凋亡DNA ladder，例如從大于3 x10⁶個細(xì)胞獲得清楚的凋亡DNA ladder，至少需要1%凋亡細(xì)胞。

3.      組織塊提取。10 mg組織塊放入小玻璃勻漿器，加200 ml溶液A，上下手動勻漿15-20次。取出勻漿液，冰上10 min。振蕩10秒。5000 rpm 10分鐘收集上清液并轉(zhuǎn)移到新離心管。執(zhí)行步驟3。

4.      步驟2吸取管底的沉淀，將導(dǎo)致凋亡DNA ladder中出現(xiàn)高分子量DNA。

按比例增加加樣量時，溶液D無須按比例多加；1 ml 溶液D可適宜于1-5倍現(xiàn)有的比例。

部分發(fā)表論文：
1 Huang Qiaojia, Lan Fenghua, Zheng Zhiyong, Xie Feilai, Han Junyong, Dong Lihong, Xie Yanchuan, Zheng Feng, 2011. Akt2 Kinase Suppresses Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (GAPDH)-mediated Apoptosis in Ovarian Cancer Cells via Phosphorylating GAPDH at Threonine 237 and Decreasing Its Nuclear Translocation. The Journal of Biological Chemistry, 286(49): 42211-42220.

2 Wei Ning, Liu Geng-Tao, Chen Xiao-Guang, Liu Qian, Wang Feng-Peng, Sun Hua, 2011. H1, a derivative of Tetrandrine, exerts anti-MDR activity by initiating intrinsic apoptosis pathway and inhibiting the activation of Erk1/2 and Akt1/2. Biochemical Pharmacology, 82(11): 1593-1603.

3 Liu Xiao Dong, Sun Hua, Liu Geng Tao, 2010. 5-Bromotetrandrine enhances the sensitivity of doxorubicin-induced apoptosis in intrinsic resistant human hepatic cancer Bel7402 cells. Cancer Letters, 292(1): 24-31.

4 Liu Xiao-shan, Jiang Jikai, Jiao Xiao-yang, Wu Ying-e, Lin Jing-hua, Cai Ying-mu, 2009. Lycorine induces apoptosis and down-regulation of Mcl-1 in human leukemia cells. Cancer Letters, 274(1): 16-24.

5 Song Jun-Qiu, Teng Xu, Cai Yan, Tang Chao-Shu, Qi Yong-Fen, 2009. Activation of Akt/GSK-3β signaling pathway is involved in intermedin1-53 protection against myocardial apoptosis induced by ischemia/reperfusion. Apoptosis, 14(9): 1061-106

6 Hou Yan, Wei Huailing, Luo Yuan, Liu Gengtao, 2010. Modulating expression of brain heat shock proteins by estrogen in ovariectomized mice model of aging. Experimental Gerontology, 45(5): 323-330. 

7 Bao Xiu Qi, Liu Geng Tao, 2008. Bicyclol: a novel antihepatitis drug with hepatic heat shock protein 27/70-inducing activity and cytoprotective effects in mice. Cell Stress and Chaperones, 13(3): 347-355. 

8 Huang Li-heng, Hu Jia-qi, Tao Wei-qun, Li Yuan-hong, Li Guan-ming, Xie Pei-yi, Liu Xiao-shan, Jiang Jikai, 2010. Gossypol inhibits phosphorylation of Bcl-2 in human leukemia HL-60 cells. European Journal of Pharmacology, 645(1-3): 9-13. 

9 Zhang Qiang, Zhao Xin-Huai, Wang Zhu-Jun, 2008. Flavones and flavonols exert cytotoxic effects on a human oesophageal adenocarcinoma cell line (OE33) by causing G2/M arrest and inducing apoptosis. Food and Chemical Toxicology, 46(6): 2042-2053.