描述：鈣黃綠素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 可分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色，用于同時(shí)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行熒光染色分析。Calcein-AM是一種對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490nm, Em=515nm），在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì) 胞 膜。進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑如BCECF-AM和CFDA相比，Calcein, AM細(xì)胞毒性極低，是最適合用于活細(xì)胞染色的熒光探針，而且不會(huì)抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞 膜，僅能穿過(guò)死細(xì)胞 膜的無(wú)序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅對(duì)死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)     觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。 試劑盒經(jīng)過(guò)優(yōu)化，單次可進(jìn)行200μl細(xì)胞懸液染色。

規(guī)格：500次

組成及保存：

Calcein-AM Solution（2mM）    50μL   -20°C 避光干燥保存

PI Solution（2 mM）           150μL   -20°C 避光干燥保存

一年有效

操作步驟：

1. 工作液的配制

1）先將低溫保存的 Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 PI 溶液（2 mM）平衡至室溫。

注意：第一次使用可對(duì)母液進(jìn)行分裝，以減少反復(fù)凍融次數(shù)。

1. 取5μl Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 12.5μl PI 溶液（2 mM）至 5ml 1xPBS緩沖液（pH 7.4），充分混勻。 得到 Calcein-AM 的工作液濃度2μM，PI 的工作液濃度5μM。

由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn)，以確定 Calcein-AM 和 PI 的最適濃度。梯度篩選的原則為 使用最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié)果。

注意：由于 Calcein-AM 的穩(wěn)定性比較差，此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，且在當(dāng)天用完。

2. 染色步驟

2.1 貼壁細(xì)胞，先用細(xì)胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3min）。

懸浮細(xì)胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細(xì)胞。

2.2 去上清，用 1xPBS緩沖液（pH7.4）洗滌細(xì)胞2~3次，去除殘留的酯酶活性。

注意：由于培養(yǎng)基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水會(huì)分解，導(dǎo)致空白上升，所以需要數(shù)次離心，用PBS洗滌數(shù)次直到完全洗凈。

2.3 制備細(xì)胞懸液，使其密度為 1×10 5~1×10 6細(xì)胞/ml。

2.4 取100μl染色工作液加入200μl細(xì)胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育15min。

注意：如果需要，可延長(zhǎng)孵育時(shí)間至 30min。

2.5 熒光顯微鏡下使用 490±10 nm 激發(fā)濾片同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞（黃綠色熒光）以及死細(xì)胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細(xì)胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進(jìn)行檢測(cè)。

注意：可以使用以下方法優(yōu)化兩種熒光染料的最佳工作濃度。

a) 在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中孵育10分鐘或在70%乙醇中孵育30分鐘制備死細(xì)胞；

b) 用0.1-10μM的PI溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅對(duì)細(xì)胞核染色，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。

c) 用0.1-10μM的Calcein-AM進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色。

注意事項(xiàng)：

1）由于 Calcein-AM 對(duì)濕度非常敏感，若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM 工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）碘化丙啶（PI）操作時(shí)一定要注意防護(hù)。若接觸到皮膚，需要立即用自來(lái)水清 洗。

3）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。