描述：

細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的階段性過(guò)程。染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300 kb的大片段，然后大約30%的染色體DNA在Ca²⁺和Mg²⁺依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180-200 bp核小體DNA多聚體。因此在細(xì)胞凋亡晚期，DNA會(huì)被降解為180-200 bp的片段，斷裂的基因組DNA上暴露出大量的3'-OH末端。末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）是一種不依賴于模板的DNA聚合酶，可以催化脫氧核苷酸結(jié)合到斷裂的DNA分子3'-OH末端。因此TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒可以用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡晚期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是在TdT酶的作用下，在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3′-OH末端摻入熒光素標(biāo)記的dUTP（FITC-12-dUTP），從而可以用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)（FITC激發(fā)450-500 nm，發(fā)射515-565 nm）。本試劑盒應(yīng)用范圍廣，適用于石蠟組織切片，冰凍組織切片、細(xì)胞爬片、細(xì)胞涂片等的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸：

冰袋（wet ice）運(yùn)輸；

本試劑盒儲(chǔ)存在-20℃，F(xiàn)ITC-12-dUTP Labeling Mix需避光儲(chǔ)存于-20℃，有效期12個(gè)月。

組成

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

1. PBS磷酸鹽緩沖液

2. 固定液：溶于PBS或其他緩沖體系的4%多聚甲醛，pH 7.4

3. 破膜液：溶于0.1%檸檬酸鈉的0.1% Triton X-100

4. 配制含0.2% Triton X-100的PBS；配制含0.1% Triton X-100及5 mg/mL BSA的PBS

5. 如需染核，需自備DAPI（2 μg/mL）或PI（1 μg/mL）

6. 如需陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，需自備DNase I

7. 如果用流式細(xì)胞儀，自備PI染液和RNase A（DNase free）

8. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性手套。

操作步驟：

一、樣品準(zhǔn)備

A. 石蠟包埋組織切片

1. 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5-10 min，重復(fù)2-3次；然后無(wú)水乙醇浸泡5 min，重復(fù)2次；最后用梯度乙醇（85%、75%、雙蒸水）各浸

泡1次，每次5 min；

2. 用PBS輕輕潤(rùn)洗切片，并去掉樣本周圍多余液體；使用組化筆沿組織外圍輪廓畫(huà)一個(gè)與組織間隔2-3 mm的小圈，便于下游通透性處理和平衡標(biāo)記操

作；在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)；

3. 配制Proteinase K工作液：按1：9的比例，用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋Proteinase K（200 μg/mL）原液，使其終濃度為20 μg/mL；

4. 每個(gè)樣本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，37℃孵育20 min；

（注：Proteinase K處理主要有助于組織和細(xì)胞后續(xù)步驟的染色試劑通透，其孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)過(guò)短都會(huì)影響后續(xù)標(biāo)記效率，為得到更好的結(jié)

果，可以優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間）

5. 用PBS溶液浸潤(rùn)清洗樣本3次，每次5 min（Proteinase K需洗滌干凈，否則會(huì)干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)），處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕

潤(rùn)；

6. （可選步驟）去掉樣本上多余的液體，將適量破膜液（溶于0.1%檸檬酸鈉的0.1% Triton X-100）滴加到組織上，充分浸潤(rùn)組織，室溫處理20

min；破膜處理完成后同樣的用PBS溶液潤(rùn)洗樣本3次，每次5 min；處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。

B. 組織冰凍切片

1. 將玻片浸沒(méi)在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室溫下孵育10-15 min；

2. 片子從固定液中取出后，通風(fēng)櫥中自然晾干；

3. 將玻片放入純水或PBS中潤(rùn)洗，去掉玻片上殘存的固定液；

4. 用組化筆沿著組織外圍輪廓畫(huà)一個(gè)與組織間隔2-3 mm的小圈，便于下游通透性處理和平衡標(biāo)記操作；在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣

本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)；

5. 配制Proteinase K工作液：按1：9的比例，用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋Proteinase K（200 μg/mL）原液，使其終濃度為20 μg/mL；

6. 每個(gè)樣本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10 min；

（注：Proteinase K處理主要有助于組織和細(xì)胞后續(xù)步驟的染色試劑通透，其孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)過(guò)短都會(huì)影響后續(xù)標(biāo)記效率，未得到更好的結(jié)

果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間）

7. 用PBS溶液潤(rùn)洗樣本2-3次，去掉多余液體（Proteinase K需洗滌干凈，否則會(huì)干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)），處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕

潤(rùn)；

8. （可選步驟）將適量破膜液（溶于0.1%檸檬酸鈉的0.1% Triton X-100）滴加到組織上，充分浸潤(rùn)組織，室溫處理20 min，破膜處理完成后同樣的

用PBS溶液潤(rùn)洗樣本，去掉

多余液體，處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。

C. 細(xì)胞爬片

1. 在Lab-Tek載玻片小室（Chamber Slides）上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS輕輕潤(rùn)洗2遍載玻片；

2. 向每個(gè)載玻片小室中加入適量的4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）固定，室溫下孵育20 min；

3. 去掉固定液，加入PBS清洗3次，每次5 min；

4. 每個(gè)樣本浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5 min進(jìn)行通透處理；

5. 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2-3次；

6. 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。

D. 細(xì)胞涂片

1. 以約2×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中，吸取50-100 μL細(xì)胞懸液滴于防脫玻片上，使用一片潔凈的載玻片輕柔涂開(kāi)細(xì)胞懸液；

2. 將玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，固定細(xì)胞，在4℃放置25 min；

3. 將玻片浸入PBS中，室溫放置5 min浸洗，重復(fù)一次；

4. 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體，用組化筆沿著細(xì)胞外圍輪廓畫(huà)一個(gè)小圈，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作，

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，切勿讓樣

品干燥；

5. 每個(gè)樣本浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5 min進(jìn)行通透處理；

6. 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2-3次；

7. 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體，處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。

二、DNase I處理陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)（可選步驟）

在樣本通透處理后，用DNase I處理樣本來(lái)準(zhǔn)備陽(yáng)性對(duì)照。

1. 將100 μL 1×DNase I Buffer（配制方法：取10 μL 10×DNase I Buffer，然后加入90 μL去離子水混勻）滴加到已通透的樣本上，室溫孵育5

min；

2. 輕輕去掉多余液體，加入100 μL含有DNase I（20 U/mL）的工作液（配制方法：取10 μL 10×DNase I Buffer，然后加入2 μL DNase I，再加

入88 μL去離子水混勻），室溫

孵育10 min；

3. 輕輕去掉多余的液體，并將載玻片在裝有PBS的染色缸中徹底洗3-4次。

(注：陽(yáng)性對(duì)照載玻片必須使用單獨(dú)的染色缸，否則陽(yáng)性對(duì)照載玻片上殘留的DNase I可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)載玻片上引入高背景)

三、標(biāo)記與檢測(cè)

1. 平衡：每個(gè)樣本滴加50 μL Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育10 min；

2. 標(biāo)記液配制：在冰上解凍FITC-12-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer，并按照Recombinant TdT enzyme：FITC-12-dUTP

Labeling Mix：Equilibration Buffer=1 μL：5 μL：50 μL（1：5：50）比例混合足夠用于所有實(shí)驗(yàn)的TdT孵育緩沖液，具體實(shí)驗(yàn)使用試劑

的體積可以根據(jù)玻片的大小進(jìn)行適當(dāng)?shù)缺壤{(diào)整；

3. 陰性對(duì)照體系：準(zhǔn)備一份不含Recombinant TdT enzyme的對(duì)照TdT孵育緩沖液，用ddH₂O替代；

4. 標(biāo)記：盡量去掉平衡的Equilibration Buffer，然后在每份組織樣本上加入56 μL TdT孵育緩沖液，在37℃孵育1 h；注意不能干片，載玻片要

避光；

5. 立即用PBS潤(rùn)洗組織樣本，清洗4次，每次5 min；

6. 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍的PBS溶液；

7. 核染色：樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液或者DAPI溶液（用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸，室溫放置8 min；

8. 封片：樣本染色完成后，用PBS清洗組織樣本3次，每次5 min，然后輕輕去掉多余液體，滴加抗熒光淬滅封片劑封片；

9. 鏡檢：立即在熒光顯微鏡下分析樣本，載玻片注意避光，PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-

dUTP摻入而定位的綠色熒光。

四、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)懸浮細(xì)胞

1. 將待檢測(cè)細(xì)胞用PBS清洗兩次，4℃離心（500g）然后重懸在500μLPBS中；

2. 固定：向樣品中加入5mL1%用PBS配制的多聚甲醛溶液，固定細(xì)胞，冰上放置20 min；

3. 細(xì)胞在4℃，300 g離心10min，去上清并用5mLPBS重懸兩次，最后用500μLPBS重懸細(xì)胞；

4. 通透：向樣品中加入5mL冰上預(yù)冷的70%乙醇，-20℃孵育4h，通透細(xì)胞；

（注：細(xì)胞也可用含0.2% Triton X-100的PBS溶液室溫5 min進(jìn)行通透）

5. 細(xì)胞用300g離心10min后用5mLPBS重懸，再次離心后用1mLPBS重懸；

6. 平衡：轉(zhuǎn)移約2×10⁶個(gè)細(xì)胞至1.5 mL的微量離心管，300 g離心10 min，去上清，并用80 μL Equilibration Buffer重懸，室溫孵育5 min；

7. 標(biāo)記液配制：在冰上解凍FITC-12-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer，并按照Recombinant TdT enzyme：FITC-12-dUTP

Labeling Mix：Equilibration Buffer=1 μL：5 μL：50 μL（1：5：50）比例混合足夠用于所有實(shí)驗(yàn)和可選陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖

液；

8. 標(biāo)記：細(xì)胞用300g離心10min，去上清將沉淀重懸在56μLTdT孵育緩沖液中，37℃孵育1h，避光。每隔15min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞；

9. 反應(yīng)完成后加入1mL20mM EDTA終止反應(yīng)，用微量移液器輕柔混勻；

10. 300g離心10min，去上清并將沉淀重懸在1 mL用PBS配制的0.1% Triton X-100溶液中，其中含5 mg/mL BSA，重復(fù)洗2次；

11. 核染色：300g離心10min，去上清并將細(xì)胞沉淀重懸在0.5mLPI溶液中，其中包含250μg無(wú)DNA酶的RNase A，在黑暗中室溫孵育細(xì)胞30 min；

12. 上機(jī)檢測(cè)：流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞，PI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞均染成紅色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。