描述：在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞 膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞 膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V 是一種分子量為35～36kD 的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V 進行熒光素FITC 標記，以標記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞 膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞 膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。 

適用：本試劑盒可應用于培養(yǎng)細胞凋亡檢測

組成：20次

     AnnexinV-FITC         100uL   

     Propidium Iodide      200uL    

    Binding Buffer（4X）  4mL

儲存條件：2-8℃  避光

操作方法：

1. 細胞樣品的準備：

A：懸浮細胞：

1）收集細胞，1000-2000rpm 5min，小心去除上清。

2）PBS洗滌細胞兩次，具體方法：用1ml 4℃預冷PBS輕輕重懸細胞，1000-2000rpm 5min，小心吸除上清。

B：貼壁細胞：

1）吸出細胞培養(yǎng)液至離心管中，用PBS洗滌，加入適量不含EDTA的胰酶細胞消化液消化細胞。

2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

3）加入以上步驟中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉移到離心管內，1000-2000rpm 5min，小心吸除上清。

注意：加入的細胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導致染色失敗。

4）PBS洗滌細胞兩次，具體方法：用1ml 4℃預冷PBS輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm  5min，小心吸除上清。

2. 用去離子水稀釋Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去離子水）；

3. 用250uL結合緩沖液重新懸浮細胞，調節(jié)其濃度為1×10⁶/ml；

4. 取100uL的細胞懸液于5ml流式管中，加入5uL Annexin V-FITC，輕輕混勻；

5. 室溫(20-25℃)避光孵育10-15min；

6. 上機前5min 加入10ul碘化丙啶PI溶液，輕輕混勻；

7. 在反應管中加入400ul PBS重懸細胞，避光保存，隨即進入流式細胞儀（FACS）檢測， Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。

流式細胞儀分析建議

1) 用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=530 nm。

2) Annexin V-FITC 的綠色熒光通過FITC 通道（FL1）檢測；PI 紅色熒光（流式Ex=488nm,

Em≥630nm）通過FL2 或FL3 通道檢測，建議使用FL3。

3) 熒光補償調節(jié)：使用經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。

注意事項：

1. 微量試劑取用前請離心集液。

2. Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。

3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要戴手套。

4. 本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不以應低于1×105，不推薦用于檢測組織樣本。

5. 推薦使用懸浮培養(yǎng)細胞。如果是貼壁細胞，需用不含 EDTA 的胰酶消化，如消化不當，可能引起假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測?？蓪⒁让赶蠹毎谋４嬖诤?2%BSA 的 PBS 中，防止進一步的損傷。

6. 細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

7. 消化貼壁細胞殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，最終導致染色失敗。

8.因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節(jié)。