描述：液體樣本總谷胱苷肽檢測(cè)試劑盒（Total Glutathione Assay Kit）是一種靈敏簡(jiǎn)單的檢測(cè)總谷胱甘肽的試劑盒。總谷胱甘肽包括還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。GSH 是細(xì)胞中巰基的主要來源，對(duì)于維護(hù)蛋白巰基適當(dāng)?shù)难趸€原狀態(tài)有重要作用，動(dòng)物細(xì)胞中GSH占總谷胱甘肽比例約90-95%。

規(guī)格：100次

儲(chǔ)存：按說明書要求保存  12個(gè)月有效  

操作步驟：

1.  樣品的準(zhǔn)備

蛋白沉淀試劑溶液配制：請(qǐng)于樣本準(zhǔn)備前，將試劑盒中提供的0.5g蛋白沉淀試劑S溶于10ml純水中，如果一次實(shí)驗(yàn)不需要使用10ml，請(qǐng)根據(jù)需要稱取配制成5%的水溶液。

血漿樣品或紅細(xì)胞的準(zhǔn)備：取新鮮血液，600g離心10分鐘，上清為血漿。對(duì)于沉淀中紅細(xì)胞，利用PBS洗滌2次。取約50μl的血漿或紅細(xì)胞，加入50μl的蛋白沉淀試劑S溶液，充分渦旋，冰浴10分鐘。4℃，10000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存。血漿樣品可取10μl直接測(cè)定或利用蛋白沉淀試劑S溶液稀釋2-5倍后測(cè)定，紅細(xì)胞樣品一般需利用蛋白沉淀試劑S溶液稀釋5-10倍后測(cè)定。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備

2.1 GSH儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的6mg GSH中加入1ml的純水，溶解并混勻，即為GSH儲(chǔ)備液，濃度為20mM。

2.2 DTNB儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的4mg DTNB中加入1ml本試劑盒提供的DMSO溶解并混勻，即為DTNB儲(chǔ)備液，濃度為10mM。

2.3 NADPH儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的5mg NADPH中加入1ml純水，溶解并混勻，即為NADPH儲(chǔ)備液，濃度為5mg/ml。

2.4 總谷胱甘肽檢測(cè)工作液的配制：根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)配制適當(dāng)量的總谷胱甘肽檢測(cè)工作液，表中試劑按比例混合后即為總谷胱甘肽檢測(cè)工作液。

2.5 NADPH工作液的配制：取NADPH儲(chǔ)備液，利用總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液稀釋10倍，配制為0.5mg/ml的NADPH工作液。每檢測(cè)一個(gè)樣品需要50μl的0.5mg/ml NADPH。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

將20mM的GSH儲(chǔ)備液用蛋白去除試劑S溶液稀釋成20、10、5、2.5、1.25、0.62μM濃度的GSH溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。由于GSH在蛋白去除S溶液中不夠穩(wěn)定，每次測(cè)定需新鮮配制系列標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

4、測(cè)定方法

4.1使用96孔板，依次加入總谷胱甘肽檢測(cè)工作液、樣品或標(biāo)準(zhǔn)品后，混勻，25℃或室溫孵育2分鐘。

4.2  參考上表，各孔加入NADPH工作液50μl，25℃孵育20分鐘。

4.3 各孔加入NADPH工作液50μl啟動(dòng)谷胱甘肽還原酶反應(yīng)后，立即開始計(jì)時(shí)，并在5、10、20分鐘等時(shí)間點(diǎn)測(cè)定A_412nm。如果樣品吸光度較低，可適當(dāng)降低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行樣品測(cè)定。

5. 數(shù)據(jù)處理

利用GSH標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得橫縱坐標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和各樣品的吸光度值計(jì)算樣品的總谷胱甘肽濃度。由于有多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)曲，可以選擇標(biāo)曲線性最好的時(shí)間點(diǎn)計(jì)算樣品總谷胱甘肽濃度。