描述：谷胱苷肽過氧化物酶檢測試劑盒Ⅱ（Glutathione PeroxidaseAssay KitⅡ）是一種簡易的利用紫外比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性的試劑盒。GPx包括含硒和不含硒的兩類，絕大部分細(xì)胞內(nèi)的GPx是含硒的。本試劑盒檢測的是含硒和不含硒的總GPx。試劑盒檢測GPx線性范圍為31-1000mU/ml，靈敏度≤31mU/ml。

原理：GPx催化GSH轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG，并還原過氧化物。谷胱甘肽還原酶（GR）可以利用NADPH還原GSSG為GSH。本試劑盒合并兩個反應(yīng)，并通過檢測NADPH減少量計(jì)算GPx活性，NADPH可以通過測定A_340nm方便定量。本試劑盒提供的有機(jī)過氧化物試劑（Cum-OOH）在沒有GPx存在的情況下不會和GSH發(fā)生反應(yīng)，也不會被細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶催化分解。因而可以較為特異地檢測出谷胱甘肽過氧化物酶的活力。

適用：本試劑盒能夠檢測動物組織勻、培養(yǎng)細(xì)胞等多種生物樣本中的GPx活性

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀，最佳工作波長340nm

組成:

儲存條件:-20℃儲存，12個月有效。NADPH配制成溶液后，可適當(dāng)分裝，-70℃儲存。GSH溶解后，-20℃儲存。

操作步驟：

1. 樣品的準(zhǔn)備

1.1 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：收集新鮮細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入200 μl細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30分鐘。4℃，10000g離心10分鐘。取上清進(jìn)行蛋白濃度定量后用于谷胱甘肽過氧化物酶活性的測定。不立即測定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活性超出測定范圍，可利用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液適當(dāng)稀釋后測定，稀釋倍數(shù)請通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

1.2 組織樣品的準(zhǔn)備：利用含1mMEDTA的PBS灌流或漂洗組織，去除組織中的血液，然后取組織樣品約20 mg,加入細(xì)胞裂解液400μl，冰浴勻漿。4℃，10000g離心10分鐘。取上清進(jìn)行蛋白濃度定量后用于谷胱甘肽過氧化物酶活性的測定。不立即測定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活性超出測定范圍，可利用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液適當(dāng)稀釋后測定，稀釋倍數(shù)請通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備

2.1 GSH儲備液的配制：在本試劑盒提供的12 mg GSSG中加入1ml的純水，溶解并混勻，即為GSH儲備液，濃度為40 mM。

 2.2 NADPH儲備液的配制：在本試劑盒提供的15mg NADPH中加入0.9ml純水，溶解并混勻，即為NADPH儲備液，濃度為20 mM。

 2.3 谷胱甘肽過氧化物酶檢測工作液的配制：根據(jù)待測樣品數(shù)參考下表配制適當(dāng)量的谷胱甘肽過氧化物酶檢測工作液，表中試劑按比例混合后即為總谷胱甘肽檢測工作液。

2.4 過氧化物工作液的配制：取30 μl過氧化物試劑（Cum-OOH）加入5ml純水中，混勻，

然后根據(jù)需要量取部分Cum-OOH水溶液，用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液稀釋10倍，即為過氧化物工作液。

注：稀釋過的過氧化物水溶液和過氧化物工作液冰浴保存請勿超過6 h。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

將20mM的NADPH儲備液用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液稀釋成500、250、125、62.5、31.2、15.6 μM濃度的NADPH溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。在本試劑盒相同反應(yīng)體系下NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線只需要測定1次。

     4. 測定方法

4.1   NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：利用上述系列濃度NADPH標(biāo)準(zhǔn)品，各取200μl到96孔板中，各孔加入NADPH量分別為100、50、25、12.5、6.2、3.1 nM，測定A_340nm。

4.2   參考下表，用96孔板，依次加入谷胱甘肽還原酶檢測工作液、樣品后，混勻，25℃或室溫孵育2分鐘。

     4.3 各孔加入過氧化物工作液50μl，25℃孵育20分鐘，注意縮短樣品之間加入NADPH的時間間隔。

4.4 各孔加入過氧化物工作液50μl啟動谷胱甘肽過氧化物酶反應(yīng)后，立即開始計(jì)時，并在2.5、5、10、20分鐘等時間點(diǎn)測定A_340nm。如果樣品吸光度下降過快，可適度稀釋樣品后測定；如果樣品吸光度下降過慢，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間進(jìn)行樣品測定。

     5. 數(shù)據(jù)處理

     利用NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得橫縱坐標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式，然后利用標(biāo)曲和各樣品的吸光度值計(jì)算樣品中剩余的NADPH量，從而換算為谷胱甘肽過氧化物酶活力（注意精確計(jì)時）。對于細(xì)胞和組織樣品，可以根據(jù)樣品中蛋白濃度測定，計(jì)算每毫克蛋白中谷胱甘肽過氧化物酶活力。由于有多個時間點(diǎn)的測定，可以選擇時間線性良好的時間段計(jì)算谷胱甘肽過氧化物酶活力。

谷胱甘肽過氧化物酶定義：在25℃，PH 7.2條件下，每分鐘將1.0μmol的還原型谷胱甘肽氧化為氧化型谷胱甘肽的谷胱甘肽過氧化物酶為1 U，1 U=1000 mU。

計(jì)算公式：酶活力(mU)=NADPH生成量（nmol）*2/反應(yīng)時間(min)。

參考文獻(xiàn)

1. Ursini, F., Maiorino, M., and Gregolin, C., 1985. The selenoenzyme phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase.Biophys.Acta. 839, 62-70.

  2. Forstrom, J.W., Zakowski, J.J., and Tappel, A.L., 1978. Identification of the catalytic site of rat liver glutathione peroxidase as selenocysteine. Biochemistry 17, 2639-2644.

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒檢測涉及氧化還原反應(yīng)，很多氧化劑和還原劑都會干擾試劑盒的測定，特別是巰基乙醇、DTT等含有巰基的試劑會嚴(yán)重干擾本試劑盒的測定；如果樣品中這些還原劑無法避免，則這些還原劑總濃度在反應(yīng)體系中須低于0.1 mM。

2. 為消除樣品中含有的可以消耗NADPH的酶的干擾，每個樣品可以設(shè)置不加過氧化物試劑的樣品對照。

3. 嚴(yán)格控制反應(yīng)的溫度和反應(yīng)時間，樣品中酶活性過低時，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間。

4. NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線只需測定1次即可，主要用于酶標(biāo)板測定體系下校正吸光系數(shù)，傳統(tǒng)文獻(xiàn)報(bào)道的NADPH吸光系數(shù)適用于分光光度計(jì)測定。

5. NADPH在溶液中容易分解，要嚴(yán)格按儲存條件保存。

6. 初次使用試劑盒時，粉末試劑和小體積液體試劑請適當(dāng)離心后使用。

7. 本產(chǎn)品僅限專業(yè)人員用于科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

8. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。