普利萊 甘油三酯試劑盒 甘油三酯含量檢測試劑盒 甘油三酯含量檢測

貨號(hào)E1003描述：甘油三酯(TG)是由甘油和脂肪酸酯化而成，是血脂的主要成分，也是機(jī)體重要的供能物質(zhì)。高甘油三酯和高膽固醇血癥是臨床常見的高脂血癥，與許多疾病相關(guān)。與血漿甘油三酯測定相比，實(shí)體組織和細(xì)胞的甘油三酯測定并非易事。本試劑盒避免了有毒的氯仿甲醇提取、繁雜的氮?dú)獯蹈珊椭|(zhì)復(fù)溶等步驟，采用高效能試劑進(jìn)行組織細(xì)胞裂解和甘油三酯抽提，而且優(yōu)化了GPO Trinder酶學(xué)反應(yīng)組分和操作步驟。簡單易行、靈敏度高檢測范圍為 20-2000μmol/L?？捎糜诰_測量動(dòng)植物組織細(xì)胞、固態(tài)食品材料、高濃度油料樣品中的甘油三酯含量。

參考文獻(xiàn)：

1.  Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145

原理：（1）脂肪酶分解血清中的甘油三酯為甘油；（2）甘油激酶將甘油磷酸化為3-磷酸甘油；（3）3-磷酸甘油被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫；在過氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

適用范圍：適用于動(dòng)物實(shí)體組織、培養(yǎng)細(xì)胞、油料植物組織、固態(tài)食品組織、高濃度油料樣品中甘油三酯含量的測定。

組成 ：  

(1)   裂解液  50ml

(2)   R1試劑 16ml

(3)   R2試劑 4ml    

(4)   4mmol/L甘油標(biāo)準(zhǔn)品1ml

       以上組分均4 oC儲(chǔ)存，6個(gè)月有效。

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或721、722型可見光分光光度計(jì)。最佳工作波長550nm，如無此波長建議優(yōu)先選用570nm、次選530、490nm。

操作步驟：

一 組織細(xì)胞裂解：

   在裂解前，組織或者細(xì)胞用PBS洗滌兩次以去除甘油

1. 原代脂肪細(xì)胞：200g，5分鐘離心收集細(xì)胞。建議每100 μl壓積（Packed Cell Volume）脂肪細(xì)胞加入1ml裂解液，震蕩裂解，而后室溫靜置10分鐘。

2. 分化脂肪細(xì)胞或非脂肪細(xì)胞：可先用胰酶消化、離心收集細(xì)胞而后進(jìn)行裂解，也可直接在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行裂解。通常情況下，可按比例每1x10⁶ 個(gè)細(xì)胞加入0.1ml裂解液，混勻后室溫靜置10分鐘。

3. 動(dòng)物組織：離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計(jì)算組織重量(約50mg)。強(qiáng)烈建議按比例每1mg組織加20μl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。強(qiáng)烈建議裂解液用量在1ml左右，保證有效的勻漿裂解與脂質(zhì)提取。用電動(dòng)高速勻漿器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。（不推薦超聲方法，因其不能完全和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量），勻漿后靜置10分鐘。

4. 植物油料種子、食品、含高油量樣品：用減量稱重法對(duì)樣品進(jìn)行精確稱重，建議按比例每1mg組織加20μl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。加入裂解液后可用研缽對(duì)樣品進(jìn)行研磨，而后將研磨液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，室溫靜置10分鐘。

二. 裂解液處理：

1. 取適量上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，進(jìn)行步驟2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量試劑盒(#P1511)進(jìn)行蛋白定量或－20oC儲(chǔ)存。

2. 70oC 加熱10分鐘，組織量多時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

3. 室溫2000rpm離心5分鐘，上層清液即可用于酶學(xué)測定。

二 工作溶液配制：按4:1比例，取4ml試劑R1與1ml試劑R2混合即可，立即使用或4oC保存<1天，變色棄去。

三 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將4mM甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μmol/L，通常取其中4~6管即可，注意設(shè)置0濃度對(duì)照反應(yīng)管。

四 甘油三酯濃度測定：

1. 參見下表進(jìn)行加樣。以96孔板為例，待測樣品體積可在5、10、20μl之間，推薦以10μl為起始加樣量。如果樣品測量值超出線性范圍，可進(jìn)行適當(dāng)稀釋，最后根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算濃度。

2. 37oC或25oC反應(yīng) 15分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測定各管OD值。

4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油三酯濃度。

附Excel作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)?，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢線-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R²值-。

5. 以每mg蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正甘油三酯含量。

                                                                         加樣比例（檢測范圍20-2000μmol/L）

                                                                        （可對(duì)樣品和工作液比例進(jìn)行微量調(diào)整）

說明：

1.  維生 素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、強(qiáng)還原劑二硫蘇糖醇、巰基乙醇等會(huì)干擾測。高濃度EDTA會(huì)干擾測定。

2.  樣本即使保存在-20oC的環(huán)境下，甘油三酯也會(huì)自發(fā)水解。因此建議樣品4oC保存時(shí)間應(yīng)短于24小時(shí)，當(dāng)-70oC保存時(shí)，也應(yīng)不超過1個(gè)月。

3.  如果室溫較低，應(yīng)延長反應(yīng)時(shí)間或在37oC進(jìn)行反應(yīng)。

4.  不同類型組織和細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量差別很大，應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的裂解液的加入量。對(duì)于脂肪組織而言，一般來說裂解液用量在20-30mg/ml即可。

以下為用本試劑盒發(fā)表的部分文章，供參考：

1、Zhang Xuequn, Yang Juntao, Guo Yuanbiao, Ye Hua, Yu Chaohui, Xu Chengfu, Xu Lei, Wu Songfeng, Sun Wei, Wei Hangdong, Gao Xue, Zhu Yunping, Qian Xiaohong, Jiang Ying, Li Youming, He Fuchu, 2009. Functional proteomic analysis of nonalcoholic fatty liver disease in rat models: Enoyl–coenzyme a hydratase down-regulation exacerbates hepatic steatosis. Hepatology, 51(4): 1190-1199.

2、Luo Zhidan, Ma Liqun, Zhao Zhigang, He Hongbo, Yang Dachun, Feng Xiaoli, Ma Shuangtao, Chen Xiaoping, Zhu Tianqi, Cao Tingbing, Liu Daoyan, Nilius Bernd, Huang Yu, Yan Zhencheng, Zhu Zhiming, 2011. TRPV1 activation improves exercise endurance and energy metabolism through PGC-1α upregulation in mice. Cell Research, doi:10.1038/cr.2011.205. 

3、Pang Shanshan, Tang Haiqing, Zhuo Shu, Qin Zang Ying, Le Yingying, 2010. Regulation of Fasting Fuel Metabolism by Toll-Like Receptor 4. Diabetes, 59(12): 3041-3048. 

4、Ding Yunfeng, Yang Li, Zhang Shuyan, Wang Yang, Du Yalan, Pu Jing, Peng Gong, Chen Yong, Zhang Huina, Yu Jinhai, Hang Haiying, Wu Peng, Yang Fuquan, Yang Hongyuan, Steinbuchel Alexander, Liu Pingsheng, 2011. Identification of the major functional proteins of Prokaryotic lipid droplets. The Journal of Lipid Research, doi:10.1194/jlr.M021899. 

5、Zhao Zhigang, Luo Zhidan, Wang Peijian, Sun Jing, Yu Hao, Cao Tingbing, Ni Yinxing, Chen Jing, Yan Zhencheng, Liu Daoyan, Zhu Zhiming, 2011. Rosiglitazone Restores Endothelial Dysfunction in a Rat Model of Metabolic Syndrome through PPARγ- and PPARδ-Dependent Phosphorylation of Akt and eNOS. PPAR Research, doi:10.1155/2011/291656. 

6、Deng Jiagang, Li Chunyang, Wang Hailian, Hao Erwei, Du Zhengcai, Bao Chuanhong, Lv Jianzhen, Wang Yi, 2011. Amygdalin mediates relieved atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice through the induction of regulatory T cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 411(3): 523–529. 

7、Zhai, W., Xu, C., Ling, Y., Liu, S., Deng, J., Qi, Y., Londos, C., Xu, G., 2010. Increased Lipolysis in Adipose Tissues is Associated with Elevation of Systemic Free Fatty Acids and Insulin Resistance in Perilipin Null Mice, Hormone Metabolic Research, 42: 247-253.

8、Yang Zhi, Yin Ji-Ye, Gong Zhi-Cheng, Huang Qiong, Chen Hao, Zhang Wei, Zhou Hong-Hao, Liu Zhao-Qian, 2009. Evidence for an effect of clozapine on the regulation of fat-cell derived factors. Clinica Chimica Acta, 408(1–2): 98-104. 

9、He Yong-Han, He Ying, Liao Xi-Lu, Niu Yu-Cun, Wang Guan, Zhao Chen, Wang Liang, Tian Ming-Jie, Li Ying, Sun Chang-Hao, 2012. The calcium-sensing receptor promotes adipocyte differentiation and adipogenesis through PPARγ pathway. Molecular and Cellular Biochemistry, 361(1-2): 321-328.