內(nèi)毒素清除劑 (Endotoxin Removal Reagent, 200 Extractions)  D1501

 

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價(jià)格
D1501	內(nèi)毒素清除劑 (Endotoxin Removal Reagent)	200次	230元

描述：內(nèi)毒素(endotoxin)的化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(lipopolysaccharides)，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分。脂多糖共價(jià)連接到非極性的疏水性類脂A(lipid A)形成帶負(fù)電荷的大分子，同時(shí)還具有一個(gè)親水性的寡糖核，因而具有疏水和親水雙重性質(zhì)。制備質(zhì)粒DNA和重組蛋白時(shí)，細(xì)菌破壁之后將釋放大量脂多糖。無(wú)論是普通制備純化程序，還是離子交換、凝膠排阻過(guò)濾、甚至是氯化銫超速離心等高級(jí)制備程序，脂多糖將不可避免地與DNA或蛋白質(zhì)牢固結(jié)合而被共同純化。脂多糖具有強(qiáng)烈的免疫活性和細(xì)胞毒性，并能產(chǎn)生多種復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，大多數(shù)情況下會(huì)明顯干擾并產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例如在DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)毒素競(jìng)爭(zhēng)性干擾轉(zhuǎn)染試劑與DNA的結(jié)合，顯著降低轉(zhuǎn)染效率，并產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性, 降低外源基因表達(dá)水平。在體轉(zhuǎn)染時(shí), 與DNA結(jié)合的內(nèi)毒素?zé)o疑是主要的致熱原¹。DNA、蛋白質(zhì)或其它樣品中內(nèi)毒素污染，無(wú)論是對(duì)原代和傳代細(xì)胞還是整體動(dòng)物均具有顯著的毒性作用。

內(nèi)毒素清除劑能與DNA、重組蛋白以及液體樣品中的內(nèi)毒素特異結(jié)合。在特定pH、鹽濃度、溫度條件下，經(jīng)過(guò)室溫12000 rpm離心，DNA或蛋白質(zhì)等保留在水相，內(nèi)毒素被濃縮到極小體積的下層相而被清除，從而達(dá)到清除內(nèi)毒素效果。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)抽提可將活性為5,000~50,000 EU/ml的內(nèi)毒素水平降低到5~0.5 EU/ml以下，即降低1,000~10,000倍。

 

適用：清除DNA、RNA、蛋白質(zhì)或其他液體樣品中的內(nèi)毒素。

 

組成：內(nèi)毒素清除劑 20 ml，200 次清除?？汕宄傆?jì)100 ml 體積的DNA、蛋白質(zhì)溶液。

 

儲(chǔ)存：4 oC儲(chǔ)存1個(gè)月，-20 oC長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

 

自備試劑：無(wú)內(nèi)毒素的高純水，沉淀DNA用的3M 醋酸鈉，TE緩沖液，異丙醇或乙醇，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑。

 

使用方法：提取前內(nèi)毒素清除劑放在冰上15分鐘，期間翻轉(zhuǎn)瓶子數(shù)次使液體均勻冰冷。預(yù)冷內(nèi)毒素清除劑、按照推薦的溫度操作絕對(duì)重要?？砂幢壤哟蠡蚩s小提取規(guī)模。

1.      a). 已純化的質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素清除：吸取500 mLDNA溶液于微型離心管，加入1/10 體積3M 醋酸鈉或1/20體積5M 氯化鈉溶液。冰水浴5分鐘。

b). 在提取質(zhì)粒時(shí)清除內(nèi)毒素：以堿裂解法質(zhì)粒提取為例，在加入裂解和中和溶液并離心去除碎片之后，吸取含DNA的上清溶液于新離心管，冰水浴5分鐘。

2.      加1/5 體積100 mL預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑，振蕩混勻，冰浴或4^oC 10分鐘。溶液應(yīng)清亮。

3.         37°C水浴，不時(shí)振蕩數(shù)次每次30秒。然后37°C孵育20-30 min或直到溶液分為兩相。

4.         12,000 rpm離心5 min，30°C。離心溫度必須至少大于25°C以上。

5.      溶液必須分為兩相，否則應(yīng)重復(fù)步驟3-4。上層水相含DNA，下層油狀相含內(nèi)毒素。

6.         將含DNA的上層水相轉(zhuǎn)移到新管，棄去油狀相。重復(fù)抽提2次，即重復(fù)步驟2-6兩次。

7.         最后加2體積的乙醇或者0.6體積的異丙醇，與DNA上清液混合。-20°C 30 min 或過(guò)夜。12,000 rpm 4°C離心10 min，棄上清。加入70%乙醇洗滌沉淀，12,000 rpm 4°C離心5 min棄上清?？諝飧稍锍恋?。加入100~200 ml 無(wú)內(nèi)毒素的高純水或緩沖液溶解沉淀。

8.      用內(nèi)毒素檢測(cè)試劑測(cè)定樣品中內(nèi)毒素活性，并與初始樣品比較。

 

說(shuō)明：

1.      DNA濃度>1mg/ml 時(shí)清除內(nèi)毒素效率降低。由于DNA和蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)，清除程序可導(dǎo)致10-20% DNA丟失，所幸的是與清除內(nèi)毒素的艱難相比DNA更容易提取制備。

2.      所有溶液應(yīng)用無(wú)內(nèi)毒素的高純水配制。所有器械材料均應(yīng)不含內(nèi)毒素。玻璃器皿可高溫烘烤，非揮發(fā)性水溶液可高壓120 °C高溫處理。

3.      步驟2~6可用于清除蛋白質(zhì)、其它溶液、水中的內(nèi)毒素。蛋白丟失約為10%左右，其中疏水性蛋白丟失稍多

 

參考文獻(xiàn)：1. Cotton, M., et al. Gene Ther. 1, 239, (1994)