CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒使用說明書

 

 

貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	目錄價（元）
E1008-1000	CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒	1000次	880
E1008-3000	CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒	3000次	1880

描述： Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒基于WST-8試劑，可對細胞增殖和細胞毒性進行快速高度靈敏的檢測。

WST-8 是一種類似于 MTT 的化合物，其在電子耦合試劑 1-Methoxy-PMS 存在的情況下，可以被活細胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成橙黃色水溶性的 Formazan。然后用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長附近(430~490nm)測定光吸收值，可反映活細胞的數(shù)量和代謝活力，并由此反映細胞的存活、增殖、生長和毒性等狀態(tài)。例如加入細胞生長因子后，增殖生長旺盛的細胞能夠還原生成更多的 Formazan，并具有較高的光吸收度；反之，抗增殖抗腫瘤或細胞毒 藥物處理后，細胞生長變慢或毒性變大，光吸收度下降。而對于同種類 型的細胞而言，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。與傳統(tǒng)的 MTT 或其他類似的方法相比，本試劑盒生成的 Formazan 是水溶性的，而且更加穩(wěn)定，其檢測的線性范圍更寬、靈敏度也更高。

 

 

特點：   ◆簡單快捷、即開即用，可進行大規(guī)模樣品檢測

 

◆與其他方法相比，檢測線性范圍更寬，靈敏度更高

 

◆對細胞無明顯毒性，可在不同時間進行多次測定，便于尋找最佳測定時間

 

 

適用： 可用于細胞增殖和細胞毒性相關(guān)的檢測，如：細胞因子等誘導(dǎo)的細胞增殖檢測；抗癌藥物等

 

對細胞有毒試劑誘導(dǎo)的細胞毒性檢測或一些藥物誘導(dǎo)的細胞生長抑制檢測等。

 

 

組成與儲存： CCK-8試劑：2mL, 5mL，?20oC 避光保存2年，4oC 避光保存1年，反復(fù)凍融可能會增加背景值。

 

 

所需儀器：酶標(biāo)儀，96孔培養(yǎng)板。

 

 

使用方法：

 

1.   使用與酶標(biāo)儀相匹配的 96 孔培養(yǎng)板。通常進行細胞增殖實驗時，每孔加 100 微升 2000 個細胞，而測定細胞毒性時，每孔加 100 微升 5000 個細胞，應(yīng)根據(jù)所用的細胞類型、增殖速度進行調(diào)整。注意設(shè)置 2-3 個重復(fù)孔，分別為接受處理的細胞組，未處理的細胞對照組和無細胞培養(yǎng)基的對照組。37 oC 培養(yǎng)細胞 24-48 小時，然后給予特定的藥物或物理化學(xué)因素刺激。

 

2.   處理結(jié)束后，向每孔每 100 μl 培養(yǎng)基中加入 10μl CCK-8 試劑（注意在加入的過程中不要產(chǎn)生氣泡，否則會影響 OD 值的讀?。?，37 oC 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時，培養(yǎng)時間的長短依據(jù)細胞種類、數(shù)量、活力等情況而定。初次實驗者，可以選擇幾個不同的培養(yǎng)時間點如 1h, 2h, 4h 用酶標(biāo)儀進行檢測，以便選擇出適宜的吸光度范圍進行實驗。

 

3.   在 450nm 測定 OD 吸光度并進行計算。如無 450nm 濾光片可用 430-490nm 范圍內(nèi)的濾光片。注意：若樣品為渾濁的細胞懸液時，可以選用大于 600nm 的波長，如 650nm 作為參比波長進行雙波長測定。

 

4.   結(jié)果判斷：細胞增殖或毒性＝100％ x (OD 實驗－OD 本底) / (OD 對照－OD 本底)。

 

其中，OD 實驗是接受處理細胞組的 OD 值，OD 對照是未處理細胞對照組的 OD 值，OD 本底是無細胞培養(yǎng)基的對照組 OD 值。處理后細胞增殖或毒性變化表示為未處理對照的百分數(shù)。

 

 

說明 ：

 

1.         在進行培養(yǎng)或檢測反應(yīng)時，為避免培養(yǎng)基蒸發(fā)體積減少，可用封口膜部分封閉培養(yǎng)板。

 

2.         為減少由于 CCK-8 試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差，可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋 CCK-8 試劑混勻后再進行加樣。

 

3.         本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶的催化反應(yīng)，因此當(dāng)檢測體系中有還原性物質(zhì)如葡萄糖、維生 素 C 等存在時，會干擾測定。

 

4.         可在非 96 孔板進行 CCK-8 測定，但需要成比例加大反應(yīng)體系。反應(yīng)后用比色杯測定 OD。

 

5.         用酶標(biāo)儀檢測之前，要確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會影響測定。

 

6.   加入 CCK-8 試劑后，培養(yǎng)時間要根據(jù)不同的細胞種類、數(shù)量和細胞狀態(tài)來確定。通常情況下，相同的培養(yǎng)時間，懸浮細胞和貼壁細胞相比，吸光度較低，可以延長培養(yǎng)時間或者增加細胞數(shù)量。此外，白細胞可能也需要較長的培養(yǎng)時間。

 

7.   培養(yǎng)基中含有酚紅時，可以通過扣除培養(yǎng)基背景本底的吸光度去除酚紅的影響，而不會對檢測產(chǎn)生影響。

 

 

 

 

參考文獻：

 

Maaria Iknoen, Pinchas Cohen et al. PNAS, 2003, 100: 13042-13047

 

Sachiko Sakon, Hiroyasu Nakano et al. The EMBO Journal, 2003, 22: 3898-3909

 

Akihide Takeuchi, Ken-ichi Isobe et al. Nature Genetics, 2003, 33: 172-176

 

Mohammed A. S. Khan, Earl R. Stadtman et al. PNAS, 2004, 101: 11560-11565