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原位雜交-原位雜交檢測-原位雜交技術
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原位雜交技術基本原理
原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列,將有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對,結合成專一的核酸雜交分子,經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。
為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件:組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物。
雜交液中的陽離子濃度通過靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩(wěn)定性,較高的鹽濃度將增加雜交體的穩(wěn)定性。大于0.4M的Na離子濃度,對Tm值、雙鏈復性速率的影響不大,但隨著Na離子濃度的降低,將顯著影響Tm值和雙鏈復性速率。
有2機溶2劑(甲酰胺)的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的條件下變性,那么應用于原位雜交,樣品必須在65~75℃的條件下進行長時間變性,這將導致樣品形態(tài)學的破壞。50%甲酰胺的應用能將雜交溫度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很強的水合性,高濃度的硫酸葡聚糖會使得核酸分子無法獲得周邊親水環(huán)境,增加了探針濃度,加快雜交反應速率。
原位雜交 (ISH) 是用于定位固定組織和細胞中特定核酸靶標的強大技術,能夠獲得與基因表達和遺傳位點相關的時間和空間信息。 雖然ISH的基本工作流程與印跡雜交近似,即核酸探針被合成、標記、純化和特異性靶標退火,但其不同之處在于前者可通過可視化顯示組織內(nèi)的結果來獲得更多信息。 如今有兩種基本方法來實現(xiàn)可視化顯示原位RNA和DNA靶標,即熒光 (FISH) 和顯色 (CISH) 檢測。 每種檢測方法本身的特點(見下表)使得FISH和CISH適用于截然不同的應用。 雖然兩種方法均使用標記的、與樣本雜交的靶標特異性探針,但每種方法用于可視化顯示樣本的儀器不同。 這里我們將強調(diào)每種方法的不同之處和各自的優(yōu)勢。
武漢思特進科技發(fā)展有限公司成立于2007年,是一家以實驗技術研發(fā)、實驗產(chǎn)品研發(fā)、日化產(chǎn)品研發(fā)、實驗項目承接為一體的高新技術公司;公司實驗中心有分子生物學平臺、細胞平臺、光鏡平臺、植物組培平臺、日化產(chǎn)品生產(chǎn)平臺;可以開展各類動、植物、細菌、細胞等生物實驗。