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主營產(chǎn)品: 科研試劑, elisa試劑盒, 染色液, 抗體試劑, 免疫學(xué)檢測服務(wù), 特殊染色服務(wù), 核酸檢測服務(wù), 生化測定服務(wù), ELISA試劑盒定制化服務(wù), 抗體定制化服務(wù), 緩沖液定制化服務(wù)
普利萊-線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)貨號-C0008-50
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線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1) C0008
描述:研究表明線粒體與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),其中線粒體跨膜電位(△ψ)的破壞,被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一,它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA 斷裂) 出現(xiàn)之前,一旦線粒體跨膜電位崩潰,則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。
試劑盒采用 JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)一種陽離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1 有單體和多聚體兩種存在狀態(tài),在低濃度時以單體形式存在,高濃度時以多聚體形式存在,兩者的發(fā)射光譜不同,但均可在流式細(xì)胞儀綠色(FL-1)通道檢測出綠色熒光,JC-1 可透過正常細(xì)胞 膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi),正常健康線粒體的膜電位(△ψ)具有極性,JC-1 依賴于△ψ的極性被迅速攝入線粒體內(nèi),并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體,多聚體發(fā)射光為紅色熒光;可被流式細(xì)胞儀的紅色(FL-2)通道檢測到,而細(xì)胞發(fā)生凋亡時,線粒體跨膜電位被去極化,JC-1 從線粒體內(nèi)釋放,紅光強度減弱,以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。
適用范圍:可應(yīng)用于細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測
規(guī)格及儲存: JC-1 50μL -20℃ 避光保存 一年有效
10×Incubation Buffer 10ml 4℃保存 一年有效
需要用到的儀器和其他試劑:流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、高速離心機、CO2 培養(yǎng)箱、微量移液器
1.5ml Microtube、載玻片、蓋玻片(熒光顯微鏡觀察需用)、PBS、滅菌去離子水
操作步驟:
1. 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡,設(shè)立陰性對照組和陽性對照組【用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑(如星形孢菌素,staurosporine),誘導(dǎo)適當(dāng)時間后經(jīng)其它檢測(如 AnnexinV 或Caspase3 活性)證實確有凋亡產(chǎn)生】,收集細(xì)胞;
2. JC-1 工作液的配置:取 2μL JC-1(500×),加入 900μL 滅菌去離子水中,劇烈渦旋充分溶解并混勻 JC-1。加入 100μL 10×Incubation Buffer,混勻后即為 1 mL JC-1 工作液。
注:細(xì)胞懸液每 50-100 萬細(xì)胞大概需 500 μL JC-1 工作液。六孔板每孔需要 1mL 的 JC-1 工作液,
其它培養(yǎng)器皿的 JC-1 工作液的用量以此類推;
3. 1×Incubation Buffer 的配置:取 100μL 10×Incubation Buffer 加 900μL 滅菌去離子水稀釋成 1
×Incubation Buffer,混勻并預(yù)熱至 37℃?zhèn)溆茫?懸浮細(xì)胞
1. 取 1×105 ~106 細(xì)胞,用PBS 洗滌細(xì)胞二次(離心 2000rpm5min);
2. 取 500μL JC-1 工作液將細(xì)胞均勻懸浮,37℃,5%CO2 的培養(yǎng)箱中孵育 15~20min;
3. 室溫離心(2000rpm,5min)收集細(xì)胞,用 1×Incubation Buffer 洗兩次:加入 1mL 1× Incubation Buffer 重懸細(xì)胞,離心收集細(xì)胞,再次加入 1mL 1×Incubation Buffer 重懸細(xì)胞,離心收集細(xì)胞;
4. 吸取 500μL 1×Incubation Buffer 重新懸浮細(xì)胞;5. 熒光顯微鏡觀察、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀分析。
貼壁細(xì)胞
(希望采用熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測,建議先收集細(xì)胞,重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法)
1. 對于六孔板,吸除培養(yǎng)液,用 PBS 洗滌細(xì)胞一次;
2. 加入 1mL JC-1 工作液,將細(xì)胞均勻覆蓋,37℃,5%CO2 的培養(yǎng)箱中孵育 15~20min;
3. 吸除上清,用 1×Incubation Buffer 洗兩次;
4. 加入 1-2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液(可含血清和酚紅);
5. 熒光顯微鏡觀察或激光共聚焦拍照分析。純化的線粒體
1. 把配置好的 JC-1 工作液用 1×Incubation Buffer 稀釋 5 倍;
2. 向 900μL 稀釋后的 JC-1 工作液中加入 100μL 總蛋白量為 10-100 ug 的純化的線粒體,37℃,
5%CO2 的培養(yǎng)箱中孵育 10~20min;
3. 熒光顯微鏡觀察、激光共聚焦拍照或熒光酶標(biāo)儀分析。
A. 熒光顯微鏡觀察
檢測 JC-1 單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm,發(fā)射光設(shè)置為 530nm;檢測 JC-1 聚合物時, 可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm,發(fā)射光設(shè)置為 590nm。
注意:此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察,檢測JC-1 單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設(shè)置,如GFP 或 FITC 時的設(shè)置;檢測 JC-1 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光,如碘化丙啶或 Cy3 時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降,并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常,細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。
正常細(xì)胞:雙色濾光片觀察則為:綠++ 紅++(高綠高紅),在同一濾光片下觀察則為黃綠色凋亡細(xì)胞:雙色濾光片觀察則為:綠++ 紅+(高綠低紅), 如在同一濾光片下觀察則為綠色
B. 流式細(xì)胞儀分析
用流式細(xì)胞儀檢測(Ex=488 nm; Em=530 nm)細(xì)胞凋亡的情況,綠色熒光通過 FITC 通道通常為 FL1 來檢測;紅色熒光通過PI 通道通常為 FL2 來檢測。
正常細(xì)胞{FL-1 亮,FL-2 亮; R1},凋亡細(xì)胞 {FL-1 亮, FL-2 暗; R2},設(shè)門的位置根椐細(xì)胞種
類、實驗 條件等不同而變化,試驗需設(shè)未經(jīng)處理的正常細(xì)胞為陰性對照組和陽性對照組,根椐陰性和陽性對照組的雙參數(shù)散點圖來設(shè)定門的位置。
C. 用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測
混勻后直接用熒光分光光度計進(jìn)行時間掃描(time scan),激發(fā)波長為 485nm,發(fā)射波長為590nm。如果 使用熒光酶標(biāo)儀,激發(fā)波長不能設(shè)置為 485nm 時,可以在 475-520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。
注意事項:
1. 微量試劑取用前請離心集液。
2. JC-1 避光保存及使用。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度 80-90%,收集細(xì)胞量在 1×106 /Test。
4. 對 pH 變化過于敏感的細(xì)胞建議用胎牛血清取代 Buffer 孵育染色及洗滌,或延長觀測時間。
5. 流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位變化受到多種因素的影響,因誘導(dǎo)劑、細(xì)胞株類型,作用時間的不同而熒光強度比例都有不同,因此沒有通用標(biāo)準(zhǔn)的補償設(shè)門指南,因此每個試驗需設(shè)陰性及陽性對照組進(jìn)行熒光補償及設(shè)門。