膠原蛋白酶2,9檢測試劑盒 (MMP Zymography assay kit)    P1700

 

描述：基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。膠原酶通過影響細胞外基質(zhì)參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿和組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視¹。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高于ELISA方法²，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應Buffer孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl血液中的MMP-2、MMP-9酶譜及活性，檢測靈敏度約為1 nM。試劑盒可進行50次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。

參考文獻：

1.          Nagase H and Woessner JF.  Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2.          Heussen C, and Dowdle EB.  Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202

 

適用: 檢測MMP-2、MMP-9酶譜及活性

 

組成與儲存 (50 assays)：12個月有效

1.  2 × SDS-PAGE non-reducing buffer   1.5 ml ,  ?20 oC 儲存

2.  10 × Substrate G   50 ml    ?20 oC 儲存

3.  10 × Buffer A   50 ml   4 oC 儲存    使用時用蒸餾水稀釋

4.  10 × Buffer B   50 ml   4 oC 儲存    使用時用蒸餾水稀釋

5.  SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液(貨號P1501)   4 oC儲存

 

操作步驟：

1.         制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS-PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，90 oC加熱5分鐘，分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2.         待測樣品1:1稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染Marker即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer等體積混合，取5-15μl上樣。

3.         低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。

4.         洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 18小時，中間換液。

5.         孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37oC孵育1~5小時。陽性對照或者血中的MMP通常37oC孵育1小時即可顯示。如MMP活性低，應延長孵育時間為10小時或過夜。

6.         顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液（操作步驟見SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

7.         條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色。MMP條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中最常見的格式。

 

說明

1.         10 mM能夠 EDTA完全抑制MMP活性。

2.         凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(貨號P2000)室溫快速干燥凝膠，作為永久記錄保留。

 

1、  Zi Y, Zhao W, Zhou J, et al. Silencing of TMSG1 enhances metastasis capacity by targeting V-ATPase in breast cancer[J]. International journal of clinical and experimental pathology, 2015, 8(2): 1312.

2、  Zhang L, Liu C, Meng X, et al. Smad2 protects against TGF-β1/Smad3-mediated collagen synthesis in human hepatic stellate cells during hepatic fibrosis[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2015: 1-12.

3、  Wang S H, Zhou J D, He Q Y, et al. MiR-199a inhibits the ability of proliferation and migration by regulating CD44-Ezrin signaling in cutaneous squamous cell carcinoma cells[J]. International journal of clinical and experimental pathology, 2014, 7(10): 7131.

4、  Wang H, Zhu Y, Zhao M, et al. miRNA-29c suppresses lung cancer cell adhesion to extracellular matrix and metastasis by targeting integrin β1 and matrix metalloproteinase2 (MMP2)[J]. PloS one, 2013, 8(8): e70192.

5、  Zhao Y, Yao R, Ouyang L, et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro[J]. Biofabrication, 2014, 6(3): 035001.

6、  Wu Y, Wang Y P, Guo P, et al. A lipoxin A4 analog ameliorates blood–brain barrier dysfunction and reduces MMP-9 expression in a rat model of focal cerebral ischemia–reperfusion injury[J]. Journal of Molecular Neuroscience, 2012, 46(3): 483-491.

7、  Li J, Fan R, Zhao S, et al. Reactive oxygen species released from hypoxic hepatocytes regulates MMP-2 expression in hepatic stellate cells[J]. International journal of molecular sciences, 2011, 12(4): 2434-2447.

8、  Lin Y, Chang G, Wang J, et al. NHE1 mediates MDA-MB-231 cells invasion through the regulation of MT1-MMP[J]. Experimental cell research, 2011, 317(14): 2031-2040.

9、  Zhang Y, Huang L, Wang C, et al. Phenanthrene exposure produces cardiac defects during embryo development of zebrafish (Danio rerio) through activation of MMP-9[J]. Chemosphere, 2013, 93(6): 1168-1175.

10、 Lei F Y, Zhou T B, Qin Y H, et al. Potential signal pathway of all-trans retinoic acid for MMP-2 and MMP-9 expression in injury podocyte induced by adriamycin[J]. Journal of Receptors and Signal Transduction, 2014, 34(5): 378-385.

11、 Deng L, Li G, Li R, et al. Rho-kinase inhibitor, fasudil, suppresses glioblastoma cell line progression in vitro and in vivo[J]. Cancer biology & therapy, 2010, 9(11): 875-884.

12、 Ma S, Yang D, Wang K, et al. Cryptotanshinone attenuates isoprenaline-induced cardiac fibrosis in mice associated with upregulation and activation of matrix metalloproteinase-2[J]. Molecular medicine reports, 2012, 6(1): 145-150.

13、 Zhu G, Kang L, Wei Q, et al. Expression and regulation of MMP1, MMP3, and MMP9 in the chicken ovary in response to gonadotropins, sex hormones, and TGFB1[J]. Biology of reproduction, 2014: biolreprod. 113.114249.