蛋白質(zhì)定量試劑盒 (BCA法)  500次   P1511 

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價(jià)格
P1511-1	蛋白定量試劑盒 (BCA法)	500次	330元
P1511-2	蛋白定量試劑盒 (BCA法)	2500次	1300元

描述：Bicinchoninic acid (BCA )法是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu²⁺絡(luò)合并將Cu²⁺還原成Cu¹⁺。BCA與Cu¹⁺結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的紫藍(lán)色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。

 

組成與儲(chǔ)存：(1) BCA Reagent 100 ml，室溫保存；(2) Cu Reagent 2 .5ml，室溫保存；(3) BSA standard 4 mg/ml 1 ml，?20oC凍存。12個(gè)月有效。可進(jìn)行500次微板(microplate)測(cè)定或100次1 ml比色杯測(cè)定。

 

所需設(shè)備：比色計(jì)、酶標(biāo)儀或微板比色儀，最佳工作波長(zhǎng)562 nm，可在540-590 nm之間。

 

工作溶液(Working Reagent, WR)配制：將50體積BCA Reagent與1體積Cu Reagent混合即為WR工作試劑，呈嫩綠色；室溫1周內(nèi)穩(wěn)定。

 

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制：用雙蒸水、0.9%生理鹽水、PBS或與待測(cè)蛋白樣品匹配的緩沖液進(jìn)行倍比稀釋: 20 μl 4000 μg/ml BSA + 30 μl稀釋溶液(H₂O/PBS/0.9%NaCl) = 50 μl (BSA=1600 μg/ml)，從中取25 μl連續(xù)倍比稀釋，得到BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液1600、800、400、200、100、50、25 μg/ml，各25 μl。通常，樣品蛋白濃度不會(huì)太高，也可以預(yù)先稀釋待測(cè)樣品，可以省略1600 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)管而直接從800或1000 μg/ml開始，能節(jié)省標(biāo)準(zhǔn)蛋白用量。

 

蛋白濃度測(cè)定：

蛋白質(zhì)濃度線性檢測(cè)范圍為10-2000 μg/ml。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定時(shí)，用1 cm光程玻璃或塑料比色皿，反應(yīng)終體積1.1 ml，比色計(jì)測(cè)定。微板測(cè)定時(shí)，用96孔板，反應(yīng)終體積225 μl，用酶標(biāo)儀、微板比色儀測(cè)定。

 

1.      標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定：將0.05~0.1 ml標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本與1 ml WR工作溶液混合。

微板測(cè)定：將25 μl標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本與200 μl WR工作溶液混合。

2.      37oC反應(yīng)30min；也可25oC室溫2小時(shí)或過夜。60oC 30 min反應(yīng)可增加檢測(cè)靈敏度至5-250μg/ml。

3.      將反應(yīng)管冷卻至室溫。測(cè)定562 nm (可在540-590 nm之間)光密度(OD)值。

4.      繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。X軸為BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度(mg/ml或μg/ml)，Y軸為各標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)應(yīng)的OD562值。用Excel擬合曲線并計(jì)算蛋白濃度。

 

表1  標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定和微板測(cè)定方案的加樣量和比例

 

 

注意事項(xiàng)

1.      37oC 30min或25oC室溫反應(yīng)2小時(shí)對(duì)測(cè)量較為便利，但嚴(yán)格來講此時(shí)反應(yīng)尚未達(dá)到終點(diǎn)，通常每10 min OD562值升高約2.3%。然而，通常在10min內(nèi)可以測(cè)定30管并不會(huì)明顯影響測(cè)定精度。

2.      BCA法檢測(cè)范圍為20-2000 μg/ml。檢測(cè)0.5~10 μg/ml高度稀釋蛋白樣品應(yīng)采用Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒(# P1510)。60oC 30 min反應(yīng)可增加檢測(cè)靈敏度至5~250μg/ml。

3.      BCA法檢測(cè)樣品中含有脂類物質(zhì)時(shí)光吸收值會(huì)偏高。樣品中EDTA或葡萄糖濃度大于10 mM不能使用BCA方法，葡萄糖濃度大于10 mM時(shí)可用改良Lowry法蛋白定量試劑盒 #P1512，EDTA大于10 mM的樣品可用Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒(# P1510)。另外，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)液體樣品蛋白抽提試劑(#P1255)沉淀后，可徹底去除干擾BCA法、Bradford法、和Lowry法蛋白測(cè)定的物質(zhì)。

4.      欲使測(cè)量能耐受下面表2所提示的最大干擾物質(zhì)濃度，并保持測(cè)量精度，應(yīng)在蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中加入相應(yīng)濃度的干擾物質(zhì)，但會(huì)給操作帶來不便。

5.      可測(cè)量吸附于固相支持物乳酶標(biāo)板、瓊脂糖、親和層系凝膠上的蛋白。

6.      每次測(cè)定應(yīng)該重新測(cè)定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

目前，使用普利萊BCA蛋白定量試劑盒發(fā)表的SCI文章已超過百篇，部分文章如下，供參考。

 

1、 Gong X, Chen Z, Liu Y, et al. Gene expression profiling of the paracrine effects of uterine natural killer cells on human endometrial epithelial cells[J]. International journal of endocrinology, 2014, 2014.

2、 Wang W, Zhao J, Yang G, et al. Heat shock protein 47 is up-regulated in conjunctival bleb scarring after filtration surgery in rats[J]. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 2015, 253(1): 91-97.

3、 Hou G, Li C, Liu S, et al. Long-term treatment with EXf, a peptide analog of Exendin-4, improves β-cell function and survival in diabetic KKAy mice[J]. Peptides, 2013, 40: 123-132.

4、 Zhang Q H, Li J C, Dong N, et al. Burn injury induces gelsolin expression and cleavage in the brain of mice[J]. Neuroscience, 2013, 228: 60-72.

5、 Zhang Y, Liu X, Zuo T, et al. Tetramethylpyrazine reverses multidrug resistance in breast cancer cells through regulating the expression and function of P-glycoprotein[J]. Medical Oncology, 2012, 29(2): 534-538.

6、 Mo Y, Yao H, Song H, et al. Alteration of Behavioral Changes and Hippocampus Galanin Expression in Chronic Unpredictable Mild Stress-Induced Depression Rats and Effect of Electroacupuncture Treatment[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014, 2014.

7、 Liu C, Huang H, Wang C, et al. Involvement of ephrin receptor A4 in pancreatic cancer cell motility and invasion[J]. Oncology letters, 2014, 7(6): 2165-2169.

8、 Wei N, Liu G T, Chen X G, et al. H1, a derivative of Tetrandrine, exerts anti-MDR activity by initiating intrinsic apoptosis pathway and inhibiting the activation of Erk1/2 and Akt1/2[J]. Biochemical pharmacology, 2011, 82(11): 1593-1603.

9、 Yang Y, Li C, Xiang X, et al. Ursolic acid prevents endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis induced by heat stress in mouse cardiac myocytes[J]. Journal of molecular and cellular cardiology, 2014, 67: 103-111.

10、 Lin F S, Shen S Q, Chen Z B, et al. 17β-Estradiol attenuates reduced-size hepatic ischemia/reperfusion injury by inhibition apoptosis via mitochondrial pathway in rats[J]. Shock, 2012, 37(2): 183-190.