武漢思特進科技發(fā)展有限公司主營：動植物，細菌，細胞生物實驗
武漢思特進科技發(fā)展有限公司主營：動植物，細菌，細胞生物實驗

間接標記的方法中應用了報告分子標記的探針，報告分子通過親和酶促的方法進行顯色。常用的報告分子如地高6辛，生物素。結(jié)合地高6辛抗6體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進行間接的底物反應檢測。地高6辛標記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測時使用的地高6辛抗6體不會結(jié)合于其他的生物分子。這是相較于生物素標記系統(tǒng)的優(yōu)勢。地高6辛抗6體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據(jù)不同的應用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測結(jié)果。但需注意，由于引入了免6疫檢測反應，在放大檢測靈敏度的同時，應注意樣品內(nèi)源性酶的滅活，以降低檢測背景。

通過不同標記方法的聯(lián)合應用，還可在同一樣本中實現(xiàn)染色體不同區(qū)域或細胞樣本中不同RNA序列的多重檢測。

原位雜交中探針的選擇

DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針均能通過不同的酶促分子反應進行標記。寡核苷酸探針的長度較短，因此避免了探針內(nèi)部退火的問題，在雜交時的滲透能力也更好，探針與靶標的接觸這是影響原位雜交是否成功的重要因素之一。DNA探針、RNA探針在合成時需要控制探針片段長度，通常300-1000bp左右，能覆蓋到較長片段的靶核酸序列，增加檢測的靈敏度。

另一種多聚體促進劑是聚丙0烯0酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點是價格低廉，粘度低（MW=90 000）。小分子化學試劑酚和Guandine thiocyanate也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應用也是有限的。而Guandine thiocyanate可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前zui常用的雜交促進劑。