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原位雜交中探針的選擇

DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針均能通過(guò)不同的酶促分子反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記。寡核苷酸探針的長(zhǎng)度較短，因此避免了探針內(nèi)部退火的問(wèn)題，在雜交時(shí)的滲透能力也更好，探針與靶標(biāo)的接觸這是影響原位雜交是否成功的重要因素之一。DNA探針、RNA探針在合成時(shí)需要控制探針片段長(zhǎng)度，通常300-1000bp左右，能覆蓋到較長(zhǎng)片段的靶核酸序列，增加檢測(cè)的靈敏度。

雜交流程

雜交液的成分主要影響了核酸雜交的復(fù)性動(dòng)力學(xué)和熱穩(wěn)定性。雜交液的基礎(chǔ)成分為：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），異源核酸（如鯡精3子DNA/tRNA/競(jìng)爭(zhēng)DNA），磷酸鈉，EDTA，SDS，鹽離子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及雜交探針。不同的應(yīng)用中進(jìn)行雜交溫度、pH、鹽離子、甲酰胺、探針濃度等條件的優(yōu)化。常用的pH范圍為6.5~7.5，較高的pH值有助于提高雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性。

另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙0烯0酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，粘度低（MW=90 000）。小分子化學(xué)試劑酚和Guandine thiocyanate也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過(guò)增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而Guandine thiocyanate可通過(guò)降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn)RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用?？傊?，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前zui常用的雜交促進(jìn)劑。