大鼠視黃醇結(jié)合蛋白4 (RBP-4)ELISA試劑盒

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    大鼠視黃醇結(jié)合蛋白4 (RBP-4)ELISA試劑盒

樣本采集與貯存細(xì)胞培養(yǎng)上清2000 × g條件下離心20m分鐘，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融。血清樣本離心管收集血清。血樣凝集 30 分鐘后，2000 × g 離心 10 分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存，避免反復(fù)凍融。血漿樣本EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。2000 × g 離心 20 分鐘收集樣本。即刻檢測， 或者分裝，-20℃以下貯存，避免反復(fù)凍融。組織樣本用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推 薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進步裂解組織細(xì)胞，可以對勻 漿液進行超聲破碎或反復(fù)凍融。后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測。細(xì)胞提取液樣本貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮 細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS 洗滌3次。每 1×106 個細(xì)胞中加入150-200μL PBS重懸并通過反 復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。注意：1）避免樣本的反復(fù)凍融，在檢測，冷凍樣本應(yīng)緩慢地恢復(fù)至室溫，輕柔混勻。 2）本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本，但是未充分驗證。 

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試劑準(zhǔn)備1）用，所有的組分都要至少復(fù)溫30min，確保充分復(fù)溫到室溫。2）濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié) 晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。 

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檢測步驟1、試劑、樣本平衡：檢測之請將所有的試劑、樣本平衡至室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。配置工作液：按面試劑準(zhǔn)備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。1）加標(biāo)準(zhǔn)品、樣本：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本孔加待測樣本50μL，空白孔不加。2）加 HRP標(biāo)記抗體：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100μL。3）孵育：使用封板膜封板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘。4）洗滌：棄掉液體，每孔加入300μL洗液洗板，靜置20s，洗滌5次。每次洗板，在吸水紙上拍 干。為獲得理想的實驗性能，必須徹底移除殘留液體。5）加底物顯色：每孔加入50μL顯色底物A、B 各50μL，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15分鐘。6）加終止液：每孔加入50μL終止液。顏色由藍色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化 明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。7）檢測讀數(shù)：在 15分鐘之內(nèi)，使用450nm酶標(biāo)儀進行檢測讀數(shù)。