豬流感(SIV)核酸檢測(cè)試劑盒(RT-PCR熒光探針法)

操作步驟
1  病毒 RNA 的提取
1.1  取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別加入裂解液 600 μL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～

5 min。

1.2  將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí) 堵塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。

1.3  棄去收集管中液體，加入 600 μL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。

1.4 重復(fù)步驟 1.3。

1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。

1.6  將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 μL，室溫靜置 1 min，13000 rpm

離心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。

2  實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 操作
設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照總和為 N，則反應(yīng)體系配制如下： 試劑 體系



無(wú)菌無(wú)核酸酶水 2.7（N+1）μL

RT-PCR 反應(yīng)液 10（N+1）μL

酶混合液 0.4（N+1）μL

熒光探針 1.9（N+1）μL



將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 15 μL。

分別取 5 μL 模板 RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記，在熒光 PCR 儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：

45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每個(gè)循環(huán)第二步（60℃ 35s）收集熒光信號(hào)，共

40 個(gè)循環(huán)。（報(bào)告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“None”）。

結(jié)果判定
1 結(jié)果分析條件設(shè)定 閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音

情況進(jìn)行調(diào)整。

豬流感(SIV)核酸檢測(cè)試劑盒(RT-PCR熒光探針法)2  結(jié)果描述及判定

陽(yáng)性對(duì)照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú) Ct 值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成 立；被檢樣品 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 AIV 陽(yáng)性；被檢樣品 30＜Ct＜37 并出現(xiàn)特定的擴(kuò) 增曲線，需重新取樣提取 RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽(yáng)性；被檢樣品 Ct 值≥37 時(shí)，超過(guò)本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判定為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn) S 型曲線，但本底較高的樣 品，應(yīng)為陰性。