本試劑盒用一對西部馬腦炎病毒(WEE)核酸檢測試劑盒(RT-PCR熒光探針法)

特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對西部馬腦炎病毒(WEE)進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于對可疑感染者的病原學(xué)診斷。 

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存、運(yùn)輸、避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

【適用儀器】

ABI系列、MJ系列、Roche系列、博日系列及其他熒光定量PCR檢測儀。
【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿，勻漿后置入潔凈的1.5ml離心管中；
液體標(biāo)本：取適量標(biāo)本13000rpm離心2min，棄上清。
1.2 DNA提取

1) 對上述處理好的標(biāo)本加入40ul 核酸提取液，100℃恒溫處理10分鐘，13,000 rpm離心5分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管，-20℃保存；
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)代檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1

管陰性對照+1管陽性對照），體系配制如下表：

試劑

WSSV 反應(yīng)液

酶液

用量（樣本數(shù)為N）

20μl

1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μl，加入相應(yīng)的

反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；

5. 結(jié)果分析判定

結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置基線（baseline）：一般情況下，對ABI 7500、7700等儀器設(shè)為6-15cycle，對PE5700設(shè)為3-15cycle,對MJ Research Option2設(shè)為6-12cycle。特殊情況可對基線適當(dāng)調(diào)整。
設(shè)置閾值（threshold）:以閾值線剛超過陰性對照擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的zui高點(diǎn)。
結(jié)果判斷
陽性：檢測樣本Ct值小于等于35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期；
可疑：檢測樣本Ct值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實驗，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；
陰性：檢測不到樣本Ct值或Ct值為40。
6. 對檢驗結(jié)果的解析

實驗室環(huán)境污染，試劑污染，標(biāo)本交叉污染會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線無對數(shù)生長期或無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)生長期，且Ct值≤32;
以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

【注意事項】

所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；
試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，混勻并短暫離心；
反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。.