5’RACE試劑盒

產品及特點研究真核基因的最基礎的工作之一就是確定其轉錄終止位點，目前最通用的方 法是 3′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman 發(fā)明的、通過 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技術，它在不建立 cDNA 文庫的前提下， 利用已知 cDNA 序列設計引物，通過往兩端延伸和擴增獲得其 3′-端序列。本試劑 盒就是根據 3′-RACE 原理而開發(fā)，它具有下列特點：

1. 即開即用，客戶不需要單獨準備各種材料。

2. 反應條件經過精心優(yōu)化，包括使用無 RNase H 活性的 MMLV 和優(yōu)化的引物。 
規(guī)格及成分 成 分 編 號 十孔盒包裝
MMLV 逆轉錄酶-RI 混合液 LM101104a 20 μL（紅蓋）
MMLV Buffer-dNTP 混合液 LM101105b 60 μL（本色蓋）
微量核酸沉淀劑 LM50903 400 μL（綠蓋）
TdT（末端轉移酶） LM120312 10 μL（白蓋）
2×TdT Buffer（含 dATP） 101105c 200 μL（黃蓋）
PCR MagicMix 3.0（含染料） 90805 1mL×2（紅蓋）
5′RACE 引物 A-引物 B 混合液 yw373374 200 μL（藍蓋）
5′RACE 引物 C yw375 200 μL（紫蓋）
RNase-Free 水 80403 1 mL（亮黃蓋）
使用手冊 101105sc 1 份
自備試劑
Poly(A) RNA（或總 RNA）、基因專一性引物 A、B、C、75%乙醇。注

自備試劑 Poly(A) RNA（或總 RNA）、基因專一性引物 A、基因專一性引物 B、超純水。

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存、有效期一年。 

使用方法 一：引物的設計和準備工作 

利用已道序列的區(qū)域設計基因專一性引物三條（A、B），其中引物 B 和 A 引物 比較，靠 3’端 10-30 個堿基，類似巢式 PCR 的引物設計。自備的基因專一性引物 的 Tm 最好跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致，即 Tm 為 58℃。引物合成后加 超純水使其濃度為 10 μM，放冰上待用。 

二：利用含 Oligo(dT)的 3’-RACE 引物 A 進行逆轉錄 

注意：MMLV 酶使用前必須短暫離心，因為它含 50%甘油，及其粘稠，否則將取不 到所需體積。

1. 在一個 PCR 管中，加入以下組分： 

成分 用量

Poly(A) RNA（或總RNA ） 0.2-2 μg（5 μg）

3′-RACE引物A（10 μM） 1 μL

MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL

RNase-Free水 補至19 μL

合計 19 μL

注意：如果可能，最好使用Poly(A) RNA作為模板。

2. 65℃保溫 5 分鐘, 展開 RNA 的二級結構，立即冰浴待用。

3. 在冰浴的 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆轉錄酶-RI 混合物。

4. 先 37℃保溫 60 分鐘，再 42℃保溫 30 分鐘進行逆轉錄反應，最后 50℃保溫 10 分鐘終止反應。

5. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀釋上步得到的 cDNA，冰浴待用。長期放置需要 放-20℃保存。 

三：利用基因專一性引物 A 和 3′ RACE 引物 B 進行一輪 PCR

6. 用不同量的 RT 反應液（即稀釋后的 cDNA 模板）設置 PCR，樣品組需要設置 模板用量梯度，單位：μL。 

7. 按下列參數進行 cDNA 第二鏈的合成和 PCR：

第 1 步，cDNA 第二鏈的合成：52-60℃ 2 分，72℃ 40 分（此步的目地是合 成第二鏈的 cDNA，復性溫度需要根據自備基因專一性引物 A 的 Tm 值決定， 一般可以從 55℃開始）。

 第二步 PCR 循環(huán)：94℃ 1 分鐘，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（此步為 PCR 擴 增，復性溫度需要根據自備基因專一性引物 A 的 Tm 值決定，一般可以從 55℃ 開始）。 最后延伸：72℃ 15 分

8. 取 5 μL PCR 反應液進行瓊脂糖凝膠電泳以確認 PCR 擴增產物。若得到目的擴 增產物需要用于后續(xù)實驗，請于-20℃保存；若沒有得到目的擴增產物，可按下 列步驟進行巢式 PCR 反應。

四：利用基因專一性引物 B 和 3′ 

9. 將上輪 PCR 產物（4 管）用水稀釋約 20 倍（在 50μL PCR 反應液中加入 1mL 超純水），然后分別作為模板進行巢式 PCR 擴增。

10. PCR 反應。按下列條件進行 PCR： 第 1-30 次循環(huán)：94℃ 1 分鐘，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（復性溫度需要根 據自備基因專一性引物 B 的 Tm 值進行優(yōu)化，一般可以從 55℃開始）。最后延 伸：72℃ 15 分。 

11. 電泳檢測。然后根據實驗結果進行 DNA 測序或 TA 克隆。