一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖?/span>

產(chǎn)品及特點(diǎn)基因的定點(diǎn)突變是重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于載體構(gòu)建、基因改造、蛋白質(zhì) 功能研究等領(lǐng)域。但傳統(tǒng)的方法需要使用單鏈 DNA 模板，而得到單鏈 DNA 模板又需要 先將基因克隆到類似 M13 這種載體中，操作過程冗長(zhǎng)。為了克服這些缺點(diǎn)，本公司將突 變位點(diǎn)設(shè)計(jì)到一對(duì)互補(bǔ)的引物中，用超保真 PCR 體系擴(kuò)增甲基化質(zhì)粒模板，然后用 Dpn I 限制性內(nèi)切酶去除原始的甲基化模板，新合成的非甲基化 DNA 通過互補(bǔ)形成帶切口的 雙鏈質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。

本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 直接使用質(zhì)粒 DNA 作為模板，免去了制備單鏈 DNA 的步驟。

2. 基于高保真 PCR，對(duì)模板 DNA 序列沒特殊要求，可以用于突變?nèi)魏涡蛄?。同時(shí)對(duì)模板的需求量很少。

3. 一管式，全部在一個(gè)優(yōu)化的緩沖體系中完成，非常簡(jiǎn)單。

4. 使用 Dpn I 去除未突變模板，突變效率高達(dá) 90%。

5. 可用于制備點(diǎn)突變，缺失突變和插入突變。

6. 本產(chǎn)品適用于 10-15 kb 的片段。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 十孔盒包裝
點(diǎn)突變專用 DNA 聚合酶 LM100212a 10 uL（紅蓋）
2×點(diǎn)突變 PCR Buffer（含 dNTP） 100212b 200 uL（綠蓋）
Dpn I 限制性內(nèi)切酶 100212c 10 uL（紫蓋）
超純水 100935 1 mL（亮黃蓋）
使用手冊(cè) 100212sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑 質(zhì)粒 DNA、突變引物、細(xì)菌轉(zhuǎn)化試劑

使用方法 一、 引物設(shè)計(jì)及注意事項(xiàng)

用于特定基因突變的引物必須用戶單獨(dú)設(shè)計(jì)，請(qǐng)參考如下一些基本原則進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1. 共需設(shè)計(jì)兩條完全互補(bǔ)的一對(duì)引物，它們覆蓋要擴(kuò)增的突變區(qū)位點(diǎn)，突變位點(diǎn)好放在引物的中心?？梢韵仍O(shè)計(jì)一條，然后就可得互補(bǔ)的另一條引物。

2. 引物的長(zhǎng)度通常為 25-45 個(gè)堿基。引物中突變位點(diǎn)任何一側(cè)都必需滿足 Tm 大于45℃的條件，Tm 計(jì)算方式為 Tm=4×(GC 堿基數(shù))＋2×(AT 堿基數(shù))。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，它的突變位點(diǎn) AAG 所放位置使左側(cè) Tm＝46；右側(cè) Tm＝48，均大于 45℃。

3. 盡量把引物的 GC 含量控制在 40％-60％，結(jié)尾的 1-3 個(gè)堿基好是 G 或 C。

4. 盡量使引物不要產(chǎn)生非常穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚體。

5. 好使用經(jīng)過 PAGE 純化的引物或更高純度的引物。

二、待突變模板質(zhì)粒的選擇

6. 必須使用從 dam＋基因型的大腸桿菌中制備得到的質(zhì)粒（甲基化）用于基因定點(diǎn)突變 PCR 的模板，如果使用 dam-基因型的大腸桿菌制備的質(zhì)粒，由于其未甲基化，Dpn I 限制性內(nèi)切酶不能把質(zhì)粒 DNA 切除，這些模板質(zhì)粒也能轉(zhuǎn)化形成轉(zhuǎn)化子，產(chǎn)生大量的假陽性，嚴(yán)重干擾后續(xù)的篩選。實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌大多數(shù)都是 dam+基因型，包括 DH5α、JM109 等，常用的 dcm-大腸桿菌只有 DM1、INV110、JM110等 SCS110 等少數(shù)幾種。

7. 待突變質(zhì)粒和目的基因的 GC 含量應(yīng)該在 40-55％，沒有任何 GC 含量超過 70%、長(zhǎng)度在 50bp 以上的區(qū)域。如果質(zhì)粒 GC 含量過高，請(qǐng)先把目的基因克隆到其它合適的載體上，再進(jìn)行基因定點(diǎn)突變反應(yīng)。如果目的基因 GC 含量過高，而突變位點(diǎn)不在高 GC 含量區(qū)域，可以先把該基因的不含高 GC 含量的一個(gè)區(qū)域克隆出來，進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果突變位點(diǎn)在高 GC 區(qū)，則可以使用高 GC 專用 PCR 反應(yīng)試劑。

三、 基因定點(diǎn)突變反應(yīng)（40uL 體系）

8. 在一個(gè)塑料離心管中加入下列成分：

成分 加入量

待突變模板質(zhì)粒 0.1-0.5 ug

2×點(diǎn)突變 PCR Buffer（含 dNTP） 20 uL

自備引物一和引物二 (10 uM) 各 1 uL

點(diǎn)突變專用 DNA 聚合酶 1 uL

補(bǔ)自備超純水到 40 uL

20190402dx

9. 放入 PCR 儀器中按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù)

變性 95℃ 1 分鐘 1 次

PCR

（注：只 18 次循環(huán)）

95℃ 40 秒

60℃ 1 分鐘 18 次

68℃ 1 分鐘/Kb

延伸 72℃ 10 分鐘 1 次

保存 4℃ 長(zhǎng)時(shí)間保持

四、Dpn I 限制性內(nèi)切酶消化：

10. PCR 反應(yīng)后，直接在 PCR 反應(yīng)體系中加入 1uL Dpn I 限制性內(nèi)切酶 （該酶在甘油保存液中會(huì)下沉到管底，故用前需要充分混勻），混勻后 37℃孵育 2 小時(shí)后樣品可以直接用于轉(zhuǎn)化，或者-20℃保存?zhèn)溆?。。DpnI 限制性內(nèi)切酶可以酶切雙鏈都被甲基化的模板質(zhì)粒，也能降解一條鏈被甲基化的雙鏈質(zhì)粒。

五. 轉(zhuǎn)化、挑克隆鑒定：

11. 每 100uL 感受態(tài)細(xì)菌（轉(zhuǎn)化效率必須在 10E7 /ug 以上）中可以加入 5-10uL 經(jīng)過Dpn I 消化后的突變產(chǎn)物，按照所使用的感受態(tài)細(xì)菌的操作方法進(jìn)行操作。強(qiáng)烈建議使用能限制甲基化質(zhì)粒的宿主菌（mcrA+或 macBC+基因型，如 DH5、HB101、JM109 等），后不要使用丟失了基于甲基化的限制性功能的宿主菌（mcrA-或macBC-基因型，如 DH10B、INV110、SURE、Tg1、XL10-Gold），這樣只有非甲基化的突變質(zhì)粒才能擴(kuò)增，可以使陽性率提高到 95%左右。在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌全部涂布到含有適當(dāng)抗生素的平板上培養(yǎng)過夜。通常會(huì)得到 50 個(gè)以下的克隆，可按常規(guī)方法制備質(zhì)粒并測(cè)序。

六、常見問題：

12. 轉(zhuǎn)化后沒有克隆或克隆數(shù)極少：(1) 感受態(tài)細(xì)菌效率不夠高，請(qǐng)檢測(cè)一下感受態(tài)細(xì)胞的效率，確保轉(zhuǎn)化效率在 10E7 轉(zhuǎn)化子/ug。(2) 把 Dpn I 消化后的產(chǎn)物用常規(guī)的乙醇沉淀濃縮，這樣就可以把所有的產(chǎn)物全部用于轉(zhuǎn)化。(3) 優(yōu)化基因定點(diǎn)突變中的PCR 參數(shù)。可以把最初的 95℃變性時(shí)間延長(zhǎng)為 2 分鐘，循環(huán)中 95℃變性的時(shí)間延長(zhǎng)至 1 分鐘，把循環(huán)中的 68℃的延伸時(shí)間改為 1.5 分鐘/kb 至 2 分鐘/kb，退火可以改為 60-55℃或 65-55℃等的 touch down，退火時(shí)間也可以適當(dāng)延長(zhǎng)。(4) 引物設(shè)計(jì)有問題。通過突變反應(yīng)中的 PCR 沒有很好地?cái)U(kuò)增出預(yù)期的突變質(zhì)粒。