DNA嵌套缺失試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)本試劑盒用于以一段 DNA 為模板，利用 Exo III 外切酶的 3 到 5 外切活性，定向制 備該 DNA 片段的系列缺失。如果將此 DNA 片段克隆到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒中，則制備的 DNA 系列缺失可以轉(zhuǎn)化，得到系列轉(zhuǎn)化子，方便今后的后續(xù)分析。其原理示意圖如下： 本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，用戶(hù)不需要單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)各個(gè)成分并進(jìn)行優(yōu)化。

2. 定向，Exo III 外切酶只能從 5’突出的 DNA 末端對(duì)應(yīng)的 3’端，或平末端 DNA 的 3’端往 5’端酶切，而從 3’突出的 DNA 末端進(jìn)行酶切的活性則極低，故只要 DNA 片段同時(shí)具備上面兩種末端結(jié)構(gòu)，就可以控制 ExoIII 外切酶的酶切方向。 3

. 最長(zhǎng)可處理 10kb 左右的 DNA 片段。

4. 本產(chǎn)品足夠 10 次嵌套缺失實(shí)驗(yàn)（含 90 個(gè)取樣點(diǎn)）。

5. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床。 
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 大扁盒包裝
Exo III 外切酶（200U/uL） LM120420a 10 uL（紅蓋）
10×Exo III 外切酶緩沖液 LM120420b 100 uL（黃蓋）
Mung Bean 核酸酶(40U/uL) 120408a 130 uL（綠蓋）
10×Mung Bean 核酸酶緩沖液 120408b 1 mL（亮黃蓋）
Klenow DNA 聚合酶（5U/uL） 131015a 40 uL（紫蓋）
5×Klenow DNA 聚合酶緩沖液
（含的 NTP）
131015b 1 mL（白蓋）
DNA 溶解液 1002 15 mL
上柱結(jié)合液 190602 30 mL
離心吸附柱（窄口） 170606 50 套×2
通用洗柱液 60408 100 mL
DNA 洗脫液 3.0 170603 10 mL
2×連接反應(yīng) Mix 100213b 250uL（本色蓋）
使用手冊(cè) 100213sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑 質(zhì)粒 DNA、限制性?xún)?nèi)切酶、細(xì)菌轉(zhuǎn)化試劑

使用方法

1. 將靶 DNA 片段克隆到任何一個(gè)克隆載體中，克隆位點(diǎn)一邊必須有能產(chǎn)生 3’突出的 內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)（此端不被酶切），另一邊有能產(chǎn)生 5’突出或平末端的內(nèi)切酶識(shí)別 位點(diǎn)（此端將被酶切）。注：產(chǎn)生 3’突出末端的內(nèi)切酶有 KpnI、PstI、SphI、 Sse83871。產(chǎn)生 5’突出末端或平末端的內(nèi)切酶有 AccI、BamHI、EcoRI、HincII、 HindIII、SalI、SmaI、XbaI、XmaI 等。由于 SacI 能在質(zhì)粒上通過(guò)星號(hào)活性產(chǎn)生 切口，故好避免使用。ApaI、SacII 和 Sfi 產(chǎn)生的 3’突出末端可以被 Exo III 外 切酶酶切，故也不可用。 

2. 制備高質(zhì)量的質(zhì)粒 DNA。注意：常規(guī)離心吸附柱方法制備的質(zhì)粒 DNA 一般都有 nick （切口），Exo III 外切酶會(huì)以這些切口為切入點(diǎn)外切 DNA 片段，產(chǎn)生隨機(jī)缺失，故 好采用氯化銫密度梯度離心法制備質(zhì)粒 DNA。也可以用 DNA 連接酶將切口連接 上（具體需要參考 DNA 連接酶的使用手冊(cè)，本產(chǎn)品不提供相關(guān)試劑）。 

3. 用一個(gè)可產(chǎn)生 3’突出的內(nèi)切酶和一個(gè)可產(chǎn)生 5’突出或平末端的內(nèi)切酶將 5-10ug 質(zhì)粒 DNA 線性化（反應(yīng)體系不要超過(guò) 250uL）。好選用一種同時(shí)跟兩種酶兼容的 酶反應(yīng)液。相關(guān)操作參考限制性?xún)?nèi)切酶供應(yīng)商提供的手冊(cè)。本試劑盒不提供此步的 相關(guān)試劑。 

4. 取少量酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)酶切效果。注意：電泳時(shí)要用沒(méi)有酶切的質(zhì)粒 DNA 做對(duì)照。

5. 如果酶切成功，則在內(nèi)切酶反應(yīng)液中加入等體積的 DNA 溶解液和 2 倍體積的上柱結(jié) 合液（如果酶切體系為 250uL，則加入 250uL DNA 溶解液和 500uL 上柱結(jié)合液）， 震蕩混勻后全部轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。

6. 室溫放置 2 分鐘后 13000g 離心 1 分鐘。

7. 加入 0.7mL 通用洗柱液，13000g 離心半分鐘。棄穿透液。 20190402dx

8. 再加入 0.3mL 通用洗柱液，13000g 離心半分鐘。棄穿透液。

9. 13000g 離心半分鐘。

10. 在離心吸附柱中加入 90uL DNA 洗脫液 3.0，室溫放置 2 分鐘。

11. 換新的收集管，13000g 離心半分鐘，得到純化的線性質(zhì)粒 DNA。標(biāo)記此管為 0 號(hào)。

12. 在 0 號(hào)管中加入 10uL 10×Exo III 外切酶緩沖液，吹打混勻放常溫待用。

13. 標(biāo)記 N 個(gè)離心管并在每個(gè)管中各加入 100uL 1×Mung Bean 核酸酶反應(yīng)液放常溫 待用。N 個(gè)離心管對(duì)應(yīng) N 個(gè)取樣點(diǎn)，本試劑盒足夠 90 個(gè)取樣點(diǎn)。每次實(shí)驗(yàn) N 設(shè)置 為多少取決于要缺失 DNA 片段的長(zhǎng)度。一般每 300bp 需要一個(gè)取樣點(diǎn)。如果要缺 失 2700bp，則需要 N=2700/300=9 個(gè)取樣點(diǎn)。

14. 在 0 號(hào)管中迅速加入 1uL（200U）Exo III 外切酶，輕柔吹打混勻，立即放 37℃并 開(kāi)始計(jì)時(shí)，1 分鐘時(shí)迅速轉(zhuǎn)移 10uL 到第 1 號(hào)裝有 100uL 1×Mung Bean 反應(yīng)液 的管中終止反應(yīng)。第 2 分鐘時(shí)迅速轉(zhuǎn)移 10uL 到第 2 號(hào)裝有 1×Mung Bean 反應(yīng) 液的管中終止反應(yīng)。依此類(lèi)推，直到 N 個(gè)離心管都完成。注意：如果需要 DNA 缺 失長(zhǎng)度間隔少于 300bp，也可以每半分鐘取樣一次。 

15. 將 N 個(gè)離心管放 65℃5 分鐘滅活 Exo III 外切酶，然后放常溫短暫離心。

16. 在每管中加入 1.3 uL（約 50U）Mung Bean 核酸酶，輕柔吹打混勻，放 37℃保 溫 30 分鐘。此步將切除單鏈 DNA 區(qū)域。

17. 在每管中加入等體積（100uL）的 DNA 溶解液和 2 倍體積（200uL）的上柱結(jié)合 液，震蕩混勻后全部轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。

18. 重復(fù)第 6-第 9 步操作。

19. 在離心吸附柱中加入 40uL DNA 洗脫液 3.0，室溫放置 2 分鐘。

20. 換新離心管做收集管，13000g 離心半分鐘，所得 N 個(gè)溶液即為純化的嵌套缺失系 列 DNA 的不同時(shí)間點(diǎn)取樣。

21. 在 N 個(gè)管中分別加入 10 uL 5×Klenow DNA 聚合酶緩沖液（含 dNTP）和 0.4 uL （2 U）Klenow DNA 聚合酶，輕柔吹打混勻，37℃保溫 15 分鐘以修平 DNA 末端。 22. 取 2.5uL 上步反應(yīng)液，加到 2.5uL 2×連接液 Mix 中，16℃保溫 1 小時(shí)。

23. 取 1uL 連接樣品轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，制備質(zhì)粒，篩選缺失長(zhǎng)度合適的轉(zhuǎn)化子。