一站式Western印跡套裝–洗膜液

產(chǎn)品及特點(diǎn)Western Blot 是檢測(cè)固定在固相基質(zhì)上的蛋白質(zhì)的免疫方法，又叫免疫印跡 （immunoblotting）。該方法的是先將蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相基質(zhì)（硝酸纖 維素膜）上；再對(duì)其進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)。由于涉及多種溶液，用戶單獨(dú)配制的 話十分繁瑣，為此天澤基因開發(fā)了本產(chǎn)品。它具有下列特點(diǎn):

1. 一站式，提供除水、樣品和抗體以外的所有成分（檢測(cè)方法有 HRP 或 AP 檢測(cè)法兩種）。

2. 即開即用，用戶不需單獨(dú)準(zhǔn)備各種成分，十分方便。

3. 靈敏，可檢測(cè) 10 pg 的蛋白質(zhì)（HRP 或 AP 檢測(cè)法）。

4. 靈活，與 SDS-PAGE、非變性 PAGE 膠、等電聚焦電泳等兼容。 
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) A 型 B 型
濕法電轉(zhuǎn)液（100928-20） LM100928 20L（干粉） 20L（干粉）
硝酸纖維素膜
（10×10 cm）
100930 20 張 20 張
Western 封膜液（81210-100） LM81210 100 mL 100 mL
Western 洗膜液（81211-250） 81211 250 mL 250 mL
抗體稀釋液（81208）成分一 81208A 100 mL 100 mL
抗體稀釋液（81208）成分二 81208B 0.5 g 0.5 g
雜交袋（90206-20） 90206 20 個(gè) 20 個(gè)
HRP 顯色試劑之 TMB 溶液 A 10 mL 無
HRP 顯色試劑之 TMB 溶液 B 10 mL 無
AP 顯色試劑之 10×AP 緩沖液 無 50 mL
AP 顯色試劑之 BCIP 溶液 無 1 mL
AP 顯色試劑之 NBT 溶液 無 1 mL
Western 抗體清除劑（80813-200） 80813 200 mL 200 mL
使用手冊(cè) 81215sc 1 份 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，顯色試劑需 4℃保存，有效期一年。

自備試劑 去離子水、濾紙、特異一抗、HRP 或 AP 標(biāo)記的二抗。

使用方法

一：轉(zhuǎn)膜（濕法電轉(zhuǎn)移）

1. 制備濕法電轉(zhuǎn)液:將濕法電轉(zhuǎn)液干粉全部溶解在 1 L 去離子水中得 20×濕法電轉(zhuǎn)液，用時(shí)用去離子水稀釋 20 倍預(yù)冷待用。

2. 根據(jù) PAGE 膠的大小剪切同樣大小的濾紙和各邊都大 1 mm 的硝酸纖維素膜（以下簡(jiǎn)稱膜）。避免手直接接觸膜。

3. 將切好的膜浸泡在新鮮稀釋的 1×濕法電轉(zhuǎn)液（下簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)移液）中 15-20分鐘。注意：好用鑷子夾住膜的一邊輕輕置于轉(zhuǎn)移液上，只讓膜下層與轉(zhuǎn)移液接觸，通過毛細(xì)管作用使整個(gè)膜浸濕。避免讓膜沉入轉(zhuǎn)移液中，否則膜與轉(zhuǎn)移液之間形成的氣泡會(huì)阻止膜的濕潤。

4. 在容器中將兩塊海綿墊、六層濾紙用轉(zhuǎn)移液浸濕。

5. 在轉(zhuǎn)移夾上依次放上一張浸濕的海綿墊、三層浸濕的濾紙、一塊 PAGE 膠（只要分離膠部分）、一張浸濕的膜、三層浸濕的濾紙、一張浸濕的海綿墊。注意：每疊加層一定要用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。膜兩邊的濾紙對(duì)不能相互接觸，否則電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)發(fā)生短路，燒壞裝置。

6. 合起轉(zhuǎn)移夾并放入轉(zhuǎn)移槽中（一定要注意方向，轉(zhuǎn)印帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)時(shí)電極方向是膜正膠負(fù)；轉(zhuǎn)印帶正電荷的蛋白質(zhì)時(shí)，電極方向是膜負(fù)膠正），然后用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液灌滿轉(zhuǎn)移槽。

7. 插上電極，一般在冷卻條件下用 100V 恒壓轉(zhuǎn)移 30-60 分鐘或冷室中 14V轉(zhuǎn)移過夜。

注意：一定要檢查電流的大小，電流一般在 0.1-0.4A。應(yīng)根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間，對(duì)于小分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)好墊 2 張或更多張膜（最多可 10 張），即使白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)過了一張膜，還會(huì)在其它膜上檢測(cè)到；對(duì)于大分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓要高一點(diǎn)，時(shí)間也要延長一點(diǎn)，開始好也用兩塊或多張膜。轉(zhuǎn)移時(shí)間長的時(shí)候特別要注意加強(qiáng)降溫措施如果目的蛋白轉(zhuǎn)移效率低，可以在轉(zhuǎn)移液中加終濃度為 20%的甲醇或

0.1%的 SDS。

8. 終止轉(zhuǎn)移后，取出膜，并在膜上剪去一個(gè)小角以標(biāo)記方向。如有必要可用自備的各種染液對(duì)膠或膜進(jìn)行染色以確定蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率。

二：封膜

1. 將膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，加 5-10 mL Western 封膜液后熱密封雜交袋開口。提供的封膜液只適用于硝酸纖維素膜和 PVDF 膜，不用于尼龍膜。

2. 室溫下用脫色搖床搖動(dòng)雜交袋 30-60 分鐘。

三：與一抗二抗結(jié)合

1. 用 5 mL Western 抗體稀釋液（配制方法：將抗體稀釋液成分二干粉到入成分一溶液中，溶解后即可。未用完的抗體稀釋液需-20℃保存）將自備的一抗稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)（一般需要稀釋 10-100000 倍使用，佳稀釋倍數(shù)跟一抗效價(jià)相關(guān)，需摸索）。

2. 剪開雜交袋的一角，倒去封膜液，加入 5 mL 新鮮稀釋的一抗溶液，加熱密封雜交袋開口。

3. 室溫下在脫色搖床上搖動(dòng)雜交袋 30-60 分鐘。

4. 用抗體稀釋液將自備的 HRP 或 AP 標(biāo)記的二抗稀釋至適當(dāng)濃度（一般需要稀釋 500-4000 倍。佳稀釋倍數(shù)跟二抗效價(jià)相關(guān)，需摸索）。

5. 剪開雜交袋的一角，倒去一抗溶液（可留存），加入 5 mL 新鮮稀釋的二抗溶液，加熱密封雜交袋開口。

6. 室溫下在脫色搖床上搖動(dòng)雜交袋 30-60 分鐘，也可過夜孵育。

7. 剪開雜交袋的一角，倒去二抗溶液（可留存）。

8. 剪開雜交袋，用鑷子取出膜，用 Western 洗膜液在器皿中洗 3 次，每次10 分鐘。

9. 根據(jù)二抗的標(biāo)記酶選擇下面兩種顯色方法之一。

五：HRP 顯色檢測(cè)（對(duì) HRP 標(biāo)記的二抗，本產(chǎn)品 A 型）

1. 將膜平放，在吸附了抗原抗體的一面加入 100-500 uL TMB 溶液 A 和

100-500 uL TMB 溶液 B，鋪滿整個(gè)膜表面（具體用量可按膜的大小增減）。

2. 置于平式搖蕩儀上，在室溫下孵育 2 至 5 分鐘，直至深藍(lán)色條帶出現(xiàn)。

3. 用鑷子夾起膜，放入去離子水中洗膜 3 次終止反應(yīng)，每次 30 分鐘。

4. 空氣中晾干后照相保存。注意：膜顯色后的顏色在數(shù)小時(shí)后將會(huì)褪色，不能存在，故需要及時(shí)照相。

六：AP 顯色檢測(cè)（對(duì) AP 標(biāo)記的二抗，本產(chǎn)品 B 型）

1. 用新鮮配制的 1×AP 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜 5 分鐘。

2. 將膜轉(zhuǎn)移到新配制的 BCIP-NBT 法 AP 顯色液中，每 cm2膜需要 0.1 mL顯色液。新鮮配制 BCIP-NBT 法 AP 顯色液（以 10 mL 為例）的方法：將9 mL 去離子水、1 mL 10×AP緩沖液、50 uL BCIP溶液和50 uL NBT溶液混勻。此溶液必須在 1 小時(shí)內(nèi)使用。

3. 室溫?fù)u晃 5-30 分鐘顯色（37℃可加速反應(yīng)）。

4. 顯色到合適程度后用自備去離子水洗膜 3 次終止反應(yīng)，每次 30 分鐘。

5. 用吸水紙吸干膜上的水分，避光干燥保存或在一周內(nèi)照相。

七：Western 抗體清除劑（說明：此處理可能會(huì)使蛋白質(zhì)失去某些表位）

1. 將膜浸泡在 Western 抗體清除劑中，70℃搖晃孵育 30 分鐘，去除一抗和二抗。用 Western 洗膜液洗膜兩次，每次 10 分鐘。

2. 膜即可用于下一次 Western 檢測(cè)的膜封堵步驟。