包涵體蛋白溶解及復(fù)性套裝

產(chǎn)品及特點用 E.coli 作為宿主表達(dá)得到的重組蛋白往往會形成包涵體，其中的重組蛋白質(zhì)只完成部分折疊，還沒形成后的正確空間結(jié)構(gòu)，所以沒有生物活性，要得到有活性的重組蛋白，還需要后續(xù)的溶解和復(fù)性（重折疊）處理。目前最常用的溶解包涵體的方法是用尿素，Sarkosyl，鹽酸胍等強變性劑，其缺點是包涵體中的重組蛋白質(zhì)被徹底變性，使后續(xù)的蛋白質(zhì)復(fù)性處理效率降低。由于包涵體中的重組蛋白質(zhì)已經(jīng)完成了部分折疊，因此本公司基于此事實設(shè)計出了此款溫和溶解-復(fù)性試劑盒，

它具有下列特點：

1. 一站式，提供包涵體洗滌、溶解和蛋白質(zhì)復(fù)性的所有試劑。

2. 采用溫和法溶解包涵體，釋放的包涵體蛋白質(zhì)不徹底變性，還能保持其部分折疊的結(jié)構(gòu)，使后續(xù)的復(fù)性處理效率提高。

3. 所用復(fù)性液基于稀釋復(fù)性，經(jīng)過精心優(yōu)化，有利于大部分蛋白的復(fù)性。

4. 還提供五種不同的添加劑，它們可以單獨加入復(fù)性液，也可以按一定比例進(jìn)行自由組合，以適應(yīng)不同的蛋白質(zhì)折疊需求。

5. 本試劑盒提供實惠的小規(guī)格，用于做預(yù)實驗用，用戶如果選擇到合適的溶液組合后，可以單獨購買其中任何一個溫和溶液以用于大量制備。

6. 本試劑盒足夠 100 次小規(guī)模（1mL 規(guī)模）的蛋白質(zhì)復(fù)性實驗。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 大紙盒包裝
包涵體洗滌液 LM100302a 250 mL
包涵體溫和溶解液之 1 LM100302b1 10 mL
包涵體溫和溶解液之 2 LM100302b2 10 mL
包涵體溫和溶解液之 3 100302b3 10 mL
包涵體溫和溶解液之 4 100302b4 10 mL
包涵體溫和溶解液之 5 100302b5 10 mL
包涵體溫和溶解液之 6 100302b6 10 mL
包涵體溫和溶解液之 7 100302b7 10 mL
包涵體溫和溶解液之 8 100302b8 10 mL
包涵體溫和溶解液之 9 100302b9 10 mL
包涵體溫和溶解液之 10 100302b10 10 mL
包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性液 100302c 250 mL
使用手冊 100302sc 1 份

運輸及保存 常溫運輸和保存，有效期一年。

自備試劑 去離子水、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、0.22 um 注射器式濾膜 

使用方法

一、洗滌包涵體：用常規(guī)方法得到的包涵體常常含有去污劑和細(xì)胞碎片，因此需

要經(jīng)過充分的洗滌才能用于本實驗。

1. 將 10mg 包涵體沉淀溶解在 5mL 包涵體洗滌液中，超聲波處理 8 次或充分吹打混勻。可以適當(dāng)留取 10-30uL 作為 SDS-PAGE 電泳樣品待用。

2. 4℃ 12000 rpm 離心 20 分鐘后棄上清。

3. 重復(fù)上面的洗滌步驟 3 次，每次留取 30uL 作為 SDS-PAGE 電泳樣品待用。

4. 將包涵體沉淀溶解在 1 mL 包涵體洗滌液中，超聲波處理 8 次或充分吹打混勻。

5. 檢查包涵體的純度：將上步得到的包涵體溶液和前幾步得到的預(yù)留樣品一起用于 SDS-PAGE 電泳，檢查每次洗滌去除雜帶的情況。

6. 檢查包涵體的濃度：用自備的 BCA 蛋白檢測試劑盒測試第 4 步得到的包涵體溶液的蛋白質(zhì)濃度。

7. 將第 4 步得到的包涵體溶液的蛋白質(zhì)濃度調(diào)到 5-10 mg/mL(如果低于此范圍，則離心后用適量的洗滌液再溶解；如果高于此范圍，則用洗滌液稀釋)，然后均分到 10 個 1.5 mL 塑料離心管中，每管 100 uL。

8. 4℃ 12000 rpm 離心 20 分鐘后棄上清。

9. 所得沉淀即純化的待用的包涵體。

二、確定溶解包涵體的佳條件：

1. 標(biāo)記上步得到的 10 個離心管，并分別加入 10 種包涵體溫和溶解液，每種 1mL。注意：準(zhǔn)確記錄它們的對應(yīng)關(guān)系。

2. 充分振蕩后，室溫放置 30 分鐘。

3. 450 nm 檢測渾濁度并記錄下數(shù)據(jù)。

4. 4℃ 12000 rpm 離心 10 分鐘后收集上清，此即包涵體溶解液。

5. 用 0.22 um 注射器式濾膜過濾包涵體溶解液。

6. 280 nm 檢測包涵體溶解液的光吸收。

7. 溶解液溶解包涵體能力跟包涵體溶液濁度跟成反比，跟包涵體溶解液中OD280 數(shù)值成正比。根據(jù)上面的數(shù)據(jù)即可確定哪種溶解液對實驗中所用包涵體具有佳溶解能力，并將在此溶解液中溶解的包涵體溶解液用于下面的復(fù)性實驗。大量處理需要從本公司大量訂購包涵體溫和型溶解液 10 種中的任 1 種。

三．包涵體蛋白的復(fù)性：

1. 在 2.5 mL 4℃預(yù)冷的、處于輕柔攪拌中的復(fù)性緩沖液中，逐滴加入上步得到的包涵體溶解液。

2. 待所有包涵體溶解液都加完后，將包涵體蛋白復(fù)性溶液用孔徑為 0.22 um 注射器式濾膜過濾，除去包涵體（直徑一般在 0.5-0.8 um）和大的聚合物。

3. 將得到的溶液用于活性檢測或離子交換柱層析和分子篩層析。