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動(dòng)植物膜蛋白微量制備試劑盒-KLANG
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店齡6年
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蔡經(jīng)理 銷售經(jīng)理
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經(jīng)營模式
生產(chǎn)廠家
所在地區(qū)
上海市閔行區(qū)
主營產(chǎn)品
動(dòng)植物膜蛋白微量制備試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn) 細(xì)胞膜蛋白質(zhì)參與了很多重要的細(xì)胞活動(dòng),根據(jù)它們與膜結(jié)合的位置一般分為兩種,一種是附著在細(xì)胞膜上,另一類是嵌入到細(xì)胞膜中間。附著型膜蛋白疏水性較弱,比較容易提取和純化;而嵌入型膜蛋白疏水型很強(qiáng),所以在水溶液里面很難溶解,非常難以提取和純化。天恩澤基因根據(jù)上述特點(diǎn),經(jīng)過精心優(yōu)化的、開發(fā)出本產(chǎn)品,專門用于分離純化這兩種膜蛋白。它具有下列特點(diǎn):
1. 兩步法提取,先純化含膜組分,再分離附著型膜蛋白和嵌合型膜蛋白。
2. 膜蛋白(附著型+嵌入型)產(chǎn)量高,對(duì)肝臟組織而言,其線粒體膜蛋白產(chǎn)率為 10 ug/mg 左右,過氧化物酶體為 1 ug/mg 左右,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為 25-30ug/mg。
3. 所得的膜蛋白大部分具有生物活性,可用于活性研究。
4. 可用動(dòng)物、植物培養(yǎng)細(xì)胞和實(shí)體細(xì)胞為材料,也可用預(yù)先純化的含膜組分或細(xì)胞器(如線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體)為材料(本試劑盒不含純化細(xì)胞器的試劑)。
5. 本方法重復(fù)性好。
6. 本試劑盒足夠 50 次微量提取,分 A 型和 B 型兩種。A 型用于附著型膜蛋白,B 型用于嵌合型膜蛋白和附著型膜蛋白。
運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸及保存,有效期一年。
自備試劑 PBS,電泳上樣液。
使用方法 1、 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞:收集 1×107 個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞(動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞),用 20 mL自備的冰浴的 PBS 洗滌三次,每次洗滌后需要 4℃下 1000 g 離心 2 分鐘,然后小心棄上清。對(duì)實(shí)體組織:由于各種動(dòng)植物的各種實(shí)體組織的屬性差別太大,故本手冊(cè)的純化膜組分的操作步驟(第 1-7 步)不一定完全適合,用戶需要自行優(yōu)化以純化含膜組分或含膜的細(xì)胞器(如細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、葉綠體等),再將含膜組分或細(xì)胞器沉淀直接用于第 8 步的膜蛋白提取。
2、 將洗滌后的細(xì)胞沉淀重懸在 2 mL 溶液 A 中,冰上靜置 10 分鐘。注意:膜蛋白有膜的保護(hù),在純化過程中對(duì)蛋白酶的降解沒有胞漿蛋白敏感,一般可以不加蛋白酶抑制劑。但如果純化的膜蛋白的確有降解的話,可以在溶液 A 中加入自備的蛋白酶抑制劑混合物。
3、 轉(zhuǎn)移到容積為 2 mL 的 Dounce 玻璃勻漿器上下勻漿 20-50 次(具體次數(shù)取決于細(xì)胞種類,293T 細(xì)胞一般需要 20 次左右,而 MEF 細(xì)胞一般需要50 次左右。用樣品先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以摸索佳勻漿次數(shù),佳勻漿次數(shù)時(shí)在顯微鏡下能看見細(xì)胞破裂但細(xì)胞核完整)。
4、 將勻漿液轉(zhuǎn)移到 15 或 50 mL 塑料管中,加入相當(dāng)于勻漿液體積 1/10 的溶液 B,其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次,留少量樣品作為對(duì)照 1(勻漿液)。
5、 4℃ 2500 rpm 離心 20 分鐘,沉淀為細(xì)胞核,上清為胞漿和膜成分,留少量樣品作為對(duì)照 2(胞漿和膜成分)。
6、 將上清液用 Beckman Optima 臺(tái)式超速離心機(jī) 100,000 g 4℃離心 60分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī),但離心力應(yīng)該為 100,000g,否則有可能得不到膜成分沉淀。
7、 小心轉(zhuǎn)移上清(胞漿部分)并留少量樣品作為對(duì)照 3(胞漿)。
8、 將沉淀(含膜組分)重懸于 1 mL 冰浴的溶液 C 中后,冰上靜置 30 分鐘,留少量樣品作為對(duì)照 4(膜成分)。本成分電泳前,需要先用自備的 TCA沉淀(TCA 終濃度為 10%),再用冰冷的丙酮洗滌兩次后再溶解在 1×上樣液中待用。對(duì)照 1-3 號(hào)不需要這樣的預(yù)處理。
9、 用 Beckman Optima 臺(tái)式超速離心機(jī) 100,000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī),但離心力應(yīng)該一致,否則有可能得不到沉淀。
10、如果需要附著型膜蛋白,則取上清(含附著型膜蛋白)棄沉淀(含膜和其中的嵌合型膜蛋白)。上清可以放-20℃長期保存,如果需要電泳,需要先用自備的 TCA 沉淀(TCA 終濃度為 10%),再用冰冷的丙酮洗滌兩次后再溶解在 1×上樣液中與對(duì)照 1-4 號(hào)一起上樣電泳。
11、如果需要嵌合型膜蛋白,則取出上清(含附著型膜蛋白)并留少量樣品作為附著型膜蛋白樣品,然后再用 1 mL 冰浴的溶液 C 重懸沉淀,然后100,000g 4℃離心 60 分鐘,去掉上清(上清含殘留的附著型膜蛋白,可 以留樣作為洗滌后的附著型膜蛋白樣品)。沉淀含膜和其中的嵌合型膜蛋 白。如果需要測(cè)定膜蛋白的濃度,則將其溶解在自備的 0.5 M NaOH 溶液
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