釀酒酵母Y187感受態(tài)細胞

產(chǎn)品及特點Y187 菌株是 Clontech 公司開發(fā)的 GAL4 系統(tǒng)酵母單雜，雙雜實驗用菌株，MATα型， 可直接轉化質?；蚺c MATa 型酵母菌株（Y2HGold，AH109 等）通過 mating 操作進行 篩庫試驗。Transformation marker 為: trp1, leu2，報告基因為：lacZ, MEL1。Y187 -GAL4 酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質粒配套使用：PGBKT7 和 PGADT7。質粒 PGBKT7 的篩 選標志為 TRP1，用于表達 DNA-BD(來自酵母轉錄因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸)與目 標蛋白(Bait)的融合蛋白；質粒 PGADT7 的篩選標志為 LEU，用于表達 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)與目標蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4 系統(tǒng)原理：一個完整的酵母 轉錄因子 GAL4 可分為功能上相互獨立的兩個結構域：位于 N 端 1~174 位氨基酸區(qū)段的 DNA 結合域（DNA-BD）和位于 C 端 768~881 位氨基酸區(qū)段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD 能夠識別 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并與之結合。而 AD 可以啟動 UAS 下游的基因進行轉錄。BD 和 AD 單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現(xiàn) 完整的 GAL4 活性，使含有 UAS 的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下，BD 不與 AD 結合，將要檢測的蛋白質分別與 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey 發(fā)生相互作用，就會促使 BD 和 AD 的相互 接近，形成完整的 GAL4，從而激活報告基因的轉錄。
規(guī)格及成分 成分 編號 包裝
Y187 感受態(tài)細胞 140389A 0.1 mL×10
PGADT7（control vector），10 ng/μL 140389B 10 μL
Carrier DNA，5 μg/μL 140389C 100 μL
PEG/liAC 140389D 5 mL
使用手冊 1 份

運輸及保存 感受態(tài)細胞干冰運輸、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/liAC、PGADT7 質粒 4℃保存；有效期半年。 

自備試劑 目的 DNA、YPDA、 SD 培養(yǎng)基等

使用方法

1. 取感受態(tài)細胞置于冰浴中。一次轉化感受態(tài)細胞的建議用量為 50-100μL，可以根據(jù) 實際情況分裝使用。 以下實驗以 100 μL 感受態(tài)細胞為例。

2. 待感受態(tài)細胞融化后，向感受態(tài)細胞懸液中依次加入預冷的目的質粒 2-5μg，Carrier DNA（95-100℃ 5 分鐘，快速冰浴，重復一次）10μL，PEG/LiAc 500μL，吹打 混勻，30℃水浴 30 分鐘（15 分鐘時翻轉 6-8 次混勻）。

3. 42℃水浴 15 分鐘（7.5 分鐘時翻轉 6-8 次混勻）。

4. 5000 rpm 離心 40 秒，棄上清。取 400μL ddH2O 重懸沉淀，5000rpm 離心 30 秒，棄上清。

5. 取 50μL ddH2O 重懸沉淀，涂板，29℃培養(yǎng) 48-96 小時。

注意：

1. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比 YPDA 培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢， 以轉化涂板為例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克??；涂 SD 單缺平 板 29℃，48-60h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆，涂 SD 雙缺平板 29℃，60-80h 培養(yǎng)可 見直徑 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板 29℃，80-90h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆。

2. 菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現(xiàn)象。當細胞在平板培養(yǎng)幾天后，平 板上的 Adenine 被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成 Adenine 以供利 用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破壞，Adenine 合成途徑受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物 P - ribosylamino imidazole（AIR） 在細胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

3. 轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。

4. 同時轉化 2-3 種質粒時可增加質粒的用量。

Y187 有兩個報告基因：lacZ, MEL1， 分別由兩種不同的啟動子（G1，M1）啟動，這兩種啟動子只有 GAL4 識別的 17bp 核心 區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。 Y187感受態(tài)細胞是實驗室常用酵母雙雜用菌株，本產(chǎn)品經(jīng)特殊工藝制作而成，經(jīng) PGADT7質粒檢測轉化效率為104 cfu/μg DNA。

菌株基因型如下：

MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1