釀酒酵母EGY48化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

EGY48 菌株是 LexA 系統(tǒng)酵母雙雜實驗用菌株，MATa 型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白 互作驗證或篩庫試驗；Transformation marker 為: his3, trp1, ura3，報告基因為： LEU2；報告基因 UAS（上游激活序列）來源于 LexA op(x6)，只有當(dāng) Bait 和 Prey 互作 時才能啟動 LEU2 表達(dá)。EGY48-LexA 酵母雙雜系統(tǒng)需要三種質(zhì)粒配套使用：pLexA、 pB42AD、p8op-LacZ。質(zhì)粒 pLexA 的篩選標(biāo)志為 HIS3，用于表達(dá) DNA-BD(來自原核 的 202 個氨基酸殘基組成的 LexA 蛋白)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒 pB42AD 的篩 選標(biāo)志為 TRP1，用于表達(dá) AD(來自皰疹病毒的 88 個氨基酸殘基組成的 B42AD 蛋白)與目 標(biāo)蛋白（Prey）的融合蛋白；報告質(zhì)粒 p8op-LacZ 的篩選標(biāo)志為 URA3，報告基因為 LacZ， 報告基因 UAS 來源于 LexA op(x8)，只有當(dāng) Bait 和 Prey 互作時才能啟動 LacZ 表達(dá)。 EGY48感受態(tài)細(xì)胞是實驗室常用酵母雙雜用菌株，

本產(chǎn)品經(jīng)特殊工藝制作而成，經(jīng) PGBKT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率為104 cfu/μg DNA。

菌株基因型如下： MATα,ura3, his3, trp1, LexAop(x6)-LEU2
規(guī)格及成分 成分 編號 包裝
EGY48 感受態(tài)細(xì)胞 140387A 0.1 mL×10
Carrier DNA，5 μg/μL 140387B 100 μL
PEG/liAC 140387C 5 mL
使用手冊 1 份

運(yùn)輸及保存 感受態(tài)細(xì)胞干冰運(yùn)輸、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/liAC 4℃保存；有效 期半年。

自備試劑 目的 DNA、YPDA、 SD 培養(yǎng)基等

使用方法

1. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100μL，可以根據(jù) 實際情況分裝使用。 以下實驗以 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞為例。

2. 待感受態(tài)細(xì)胞融化后，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒 2-5μg，Carrier DNA（95-100℃ 5 分鐘，快速冰浴，重復(fù)一次）10μL，PEG/LiAc 500μL，吹 打混勻，30℃水浴 30 分鐘（15 分鐘時翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻）。

3. 42℃水浴 15 分鐘（7.5 分鐘時翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻）。

4. 5000 rpm 離心 40 秒， 棄上清。取 400μL ddH2O 重懸沉淀，5000rpm 離心 30 秒，棄上清。

5. 取 50μL ddH2O 重懸沉淀，涂板，29℃培養(yǎng) 48-96 小時。

注意：

1. EGY48 酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為 27-30℃；高于 31℃，生長速度和轉(zhuǎn) 化效率呈指數(shù)下降。

2. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比 YPDA 培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢， 以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克??；涂 SD 單缺平 板 29℃，48-60h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆，涂 SD 雙缺平板 29℃，60-80h 培養(yǎng)可 見直徑 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板 29℃，80-90h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4. 同時轉(zhuǎn)化 2-3 種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。