大腸桿菌DH10B化學感受態(tài)細胞

產(chǎn)品及特點本產(chǎn)品是采用大腸桿菌 DH10B 菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細胞，可直接用于 DNA 的化學轉(zhuǎn)化。本試劑盒具有下列特點：

1. 使用 pUC19 質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達 108，-80℃保存幾個月轉(zhuǎn)化效率不改變。

2. 可用于高效轉(zhuǎn)化 150Kb 大小的質(zhì)粒，可用于藍、白斑篩選。

3. 本產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，使用方便，質(zhì)優(yōu)價廉。

4. DH10B 菌株基因型是 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK λrpsLnupG。

其基因型符號及其含義列表如下：

基因型符號 含義K-12

K-12系的所有菌種默認都攜帶F因子和?、e14、rac三種原噬菌體。其中的e14攜帶野生型mcrA基因，其產(chǎn)物可對甲基化的CG切割。F

? 本菌種缺失F因子

?? 本菌種缺失?原噬菌體

araD139 不能代謝阿拉伯糖

△(ara-leu)7697 不能自身合成亮氨酸

endA1 核酸內(nèi)切酶 I 缺失

??80lacZ?M15]

?80原噬菌體上攜帶lacZ?M15，其編碼?-半乳糖苷

酶基因?片段，與攜帶?片段的質(zhì)粒互補可恢復(fù)酶

活性，用于藍白斑篩選

galE15

UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶失活，不能利用半乳

糖，對 2 脫氧半乳糖抗性，LPS 合成缺失，轉(zhuǎn)化

效率高

galK16

半乳糖激酶失活，不能利用半乳糖，對 2 脫氧半

乳糖抗性

△lacX74 lac操縱子和鄰近區(qū)域缺失，不能代謝乳糖

mcrA

在此菌種中，e14原噬菌體攜帶的mcrA基因缺

失，故不能對甲基化的CG切割

△(mrr–

hsdRMS-mcrBC)

缺失對甲基化C的限制、缺失EcoK修飾限制系

統(tǒng)，缺失對甲基化A的限制

nupG

同deoR，核苷酸轉(zhuǎn)運突變，使得細胞組成型合成

核苷酸，用于質(zhì)粒制備

recA1

ATP依賴型重組酶失活，recBCD、recE和recF

三條重組路徑均復(fù)喪失，重組率降低1萬倍。適合

擴增有回文結(jié)構(gòu)的高拷貝質(zhì)粒

rpsL 30S核糖體S12突變，導(dǎo)致對鏈霉素抗性

規(guī)格及成分 成分 編號 小扁盒包裝

大腸桿菌 DH10B 化學感受態(tài)細胞 140374 0.1 mL×10

使用手冊 140374sc 1 份

運輸及保存 干冰運輸、-80℃保存，有效期半年。

自備試劑 目的 DNA、SOC 或 LB 培養(yǎng)基等

使用方法 1. 取感受態(tài)細胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的建議用量為 50-100μl，可以根

據(jù)實際情況分裝使用。

以下實驗以 50 μl 感受態(tài)細胞為例。

2. 待感受態(tài)細胞融化后，向感受態(tài)細胞懸液中加入目的 DNA（根據(jù)實際情況加入適量的 DNA，通常 100 μl 感受態(tài)細胞能夠被 1 ng 超螺旋質(zhì)粒 DNA 所飽和），用移液器輕輕吹打混勻，冰浴 30 分鐘。

3. 42℃熱擊 90 秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置 2-3 分鐘。

4. 每個離心管中加入 450 μl 無菌的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于

37℃搖床，150 rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘使菌體復(fù)蘇。

5. 根據(jù)實驗需求，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，加到含有相應(yīng)抗生素的 SOC 或 LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于 37℃直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng) 12-16 小時。

注意：

1. 涂布用量可根據(jù)具體實驗調(diào)整。若轉(zhuǎn)化的 DNA 總量較多，可取少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布

平板；若轉(zhuǎn)化的 DNA 總量較少，可取 200-300 μl 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。若預(yù)計的克數(shù)較少，可通過離心（4,000 rpm ，2 分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于平板中。

2. 新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于 37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。

3. 涂布剩余的菌液可置于 4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少，可以將剩下的菌液

再涂布新培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。