大腸桿菌DH10Bac化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品是采用特殊工藝處理得到的大腸桿菌 DH10 Bac 感受態(tài)細(xì)胞，適用于昆蟲桿狀 病毒 Bac-to-Bac 系統(tǒng)中同源重組的菌株，用于產(chǎn)生重組 Bacmid。使用 pUC19 質(zhì)粒檢測， 本產(chǎn)品轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 107CFU/μg。

DH10Bac 細(xì)胞包含親本 Bacmid bMON14272 和輔助質(zhì)粒 pMON7124。親本 Bacmid 包含一個(gè) mini-F 復(fù)制子、卡那霉素抗性基因、att Tn7 位點(diǎn)和 lac Zα-互補(bǔ)因子。 輔助質(zhì)粒包含 tns ABCD 區(qū)域，該區(qū)域提供了 mini-Tn7 從供體質(zhì)粒插入親本 Bacmid 靶 位點(diǎn)所需要的轉(zhuǎn)座蛋白。供體如 pFastBac 系列質(zhì)粒（pFastBac1，pFastBacDual 等） 含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重組臂，Tn7R 和 Tn7L 之間包含慶大霉素抗性基因、昆蟲病毒 多角體基因啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和 SV40 病毒的 PolyA 加尾信號(hào)。當(dāng)含有靶基因 pFastBac 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 DH10Bac 細(xì)胞后，發(fā)生重組后就可產(chǎn)生重組 Bacmid，提取純化重組 Bacmid 轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞 Sf9 或 Sf21 就可以包裝產(chǎn)生昆蟲病毒。此外，DH10Bac 細(xì)胞中的 The φ80dlacZDM15 基因的產(chǎn)物可以實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的α-互補(bǔ)現(xiàn)象，用于重組 bacmid 的藍(lán)白斑篩選。

菌株基因型為：F - mcrA Δ(mrr -hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK λrpsL nupG/pMON14272/pMON7124
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 包裝
本產(chǎn)品 140576 0.1 mL×10
使用手冊 1 份

運(yùn)輸及保存 干冰運(yùn)輸、-80℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期半年。

自備試劑 重組質(zhì)粒、SOC 或 LB 培養(yǎng)基等

使用方法

1. 制備含 有如 下抗生 素的 LB 固 體平板 ：50 μ g/mL Kanamycin ，7 μ g/mL gentamicin，10 μg/mL tetracycline，100 μg/mL X-gal，40 μg/mL IPTG。

2. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100 μL，可以根據(jù) 實(shí)際情況分裝使用。 以下實(shí)驗(yàn)以 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞為例。 3. 待感受態(tài)細(xì)胞融化后，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入 1-10 ng 重組質(zhì)粒，用移液器輕輕吹 打混勻，冰浴 30 分鐘。

4. 42℃熱擊 90 秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置 2-3 分鐘。

5. 每個(gè)離心管中加入 900 μL 無菌的 SOC（不含抗生素），混勻后置于 37℃ 搖床， 200rpm 振蕩培養(yǎng) 4 小時(shí)。

6. 用 SOC 培養(yǎng)基進(jìn)行 10 倍梯度稀釋，如分成 3 個(gè)稀釋梯度 10-1 ,10-2 ,10-3。

7. 取 100 μL 的各個(gè)梯度的培養(yǎng)物用于涂布。等平板中的液體完全吸收后，倒置平板， 37℃培養(yǎng) 24-48 小時(shí)。

8. 保留剩余的菌液保存于 4℃，視平板上菌落生長情況決定去留。

注意：

1. 涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。

2. 新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于 37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。

3. 涂布剩余的菌液可置于 4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少，可以將剩下的菌液再 涂布新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。