產品名稱：質型多角體病毒PCR檢測試劑盒

組成及試劑配制:

1、 酶標板：一塊（96孔）

2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

反應五要素：

參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)*個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

操作使用方法：

注：所有試劑使用前需完全解凍，混合均勻，6,000rpm離心數(shù)秒后使用。

1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）

待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等，具體提取方法請參照相關說明書。陽性質控品及陰性質控品無需提取，可直接使用。

2. 擴增試劑準備（PCR前準備區(qū)）

取N個（N=陰性質控品+待檢樣本+陽性質控品）PCR反應管，每管分別加入FMD RT-PCR反應液19μl、RT-PCR酶1 μl (也可根據(jù)每頭份用量計算N+1份FMD RT-PCR反應液、RT-PCR酶所需總量，兩者混勻離心后分裝20 μl至單個PCR反應管)。

組分每頭份用量FMD  RT-PCR反應液19 μlRT-PCR酶。

1 .將所有PCR反應管于6,000rpm離心30s，轉移至樣本處理區(qū)。

2.加樣（樣本處理區(qū)）

3.在上述的PCR反應管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性質控品和陽性質控品各5 μl，蓋緊管蓋，于6,000rpm離心10s，轉移至擴增區(qū)。

質型多角體病毒PCR檢測試劑盒樣本采集、存放及運輸：

1、樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集。

2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（zui多凍融3次）。

3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。